单克隆抗体的应用前景课件

单克隆抗体的

应用前景及进展——动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。概念？特定抗原一种B细胞特异性抗体刺激产生杂交瘤细胞

挑选出一个产生特异性抗体的细胞在体外持久培养进行克隆增殖，便可同时得到大量均一的单克隆抗体。但是抗体形成细胞在体外持久培养困难，如脾细胞体外培养一般一周内死亡。可是恶性肿瘤细胞的特点之一是在体外培养中可无限期地增殖。用淋巴细胞杂交瘤技术，使抗体形成细胞和骨髓瘤细胞杂交，得到的杂交瘤细胞。这种细胞保持了亲代细胞双方的特性，既具有肿瘤细胞在体外培养中可以无限期地增殖的特性，又具有抗体形成细胞的不断分泌特异性抗体的特性。优点——和常规抗血清相比1.特异性强：单克隆抗体是针对抗原分子表面抗原决定簇的，有人陈为“单特异性”。它是研究生物大分子和细胞表面细微结构以及诊断治疗疾病的有力工具。2.可大量生产，容易标准化：一旦获得1株杂交瘤细胞株，就可以无限制地反复制备出相同特异性的单克隆抗体。由于来自同一株细胞，很容易标准化。3.用不纯的抗原，可以制备出纯的单克隆抗体。用这种抗体又可以提纯抗原。

因为具有上述特点，单克隆抗体应用范围很广，几乎渗透到生物医学的每一个领域，在生物医学研究，临床医学，军事医学和工业生产上都有重要的实用意义。单克隆抗体，简称单抗药物，有“生物导弹”之称，目前是生物制药产业中最大类别的产品，也是生物制药产业中增长最快的领域之一。全球领先的医药健康咨询服务公司IMSHealth数据显示，2009年全球15大畅销药品中，抗体药物占据了1/3。业内人士普遍认为，单克隆抗体药物是中国生物医药产业发展潜力最为巨大的新药方向。前景：应用前景单克隆抗体能与其相应的抗原特异性结合，因而能够从复杂系统中识别出单个成分。只要得到针对某一成分的单克隆抗体，利用它作为配体，固定在层析柱上，通过亲合层析，即可从复杂的混和物中分离、纯化这一特定成分。例子：用抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)亲合层析柱，就可从孕妇尿中提取到纯的hCG。与其它提取方法(沉淀法、高效疏水色谱法等)相比，具有简便、快速、经济、产品活性高等优点。1作为亲合层析的配体抗人T淋巴细胞单抗(McAb)作为一种新型免疫抑制剂，已广泛应用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应。其作用机理有赖于McAb的种类及其免疫学特性。例1：注射抗小鼠Thy-1抗原的单抗，可以抑制小鼠同种皮肤移植的排斥反应。

例2：对用于同种骨髓移植的供体骨髓，在体外经抗T细胞单抗加补体处理，能减轻移植物抗宿主病的发生。3作为免疫抑制剂利用单克隆抗体的特性可把它作为研究工作中的探针。此时，可以从分子、细胞和器官的不同水平上，研究抗原物质的结构与功能的关系，进而并可从理论上阐明其机理。例子：用荧光物质标记单抗作为探针，能方便地确定与其结合的相应生物大分子(蛋白质、核酸、酶等)在细胞中的位置和分布。

制作生物芯片（即蛋白质芯片）以及用于western杂交。

4作为研究工作中的探针单克隆抗体作为医学检验试剂，更能充分发挥其优势。单克隆抗体的特异性强，大大提高了抗原—抗体反应的特异性，减少了和其它物质发生交叉反应的可能性，使试验结果可信度更大。单抗的均一性和生物活性的单一性，使抗原—抗体区应结果便于控制，利于标准化和规范化。目前已有许多检验试剂盒用单抗制成，其主要用途如下：6作为医学检验试剂(1)诊断各类病原体这是单抗应用最多的领域，已有大量诊断试剂商品供选择。如用于诊断乙肝病毒、丙肝病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒和各种微生物、寄生虫感染的试剂等。单抗所具有的灵敏度高、特异性好的特点，使其在鉴别菌种的型及亚型、病毒变异株，以及寄生虫不同生活周期的抗原性等方面更具独特优势

用于肿瘤的诊断、分型及定位。

尽管目前尚未制备出肿瘤特异性抗原的单抗，但对肿瘤相关抗原(如甲胎蛋白、肿瘤碱性蛋白和癌胚抗原)的单抗早就用于临床检验。随着淋巴细胞杂交瘤技术的应用，许多抗人肿瘤标记物的杂交瘤细胞株已经建立，这为肿瘤的早期诊断及其阐明肿瘤的发生、发展，了解肿瘤细胞的生物学活性及其定量研究奠定了基础。用抗肿瘤单抗检查病理标本，可协助确定转移肿瘤的原发部位。以放射性核素标记单抗可用于体内诊断，再结合X-线断层扫描技术，可对肿瘤的大小及其转移灶作出定量诊断。

(2)肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的检测用于区分细胞亚群和细胞的分化阶段。

例如检测CD系列标志，有利于了解细胞的分化和T细胞亚群的数量和质量变化，这对多种疾病诊断具有参考意义。细胞表面抗原的检测，将对白血病患者的疾病分期、治疗效果、预后判断等方面有指导作用。组织相容性抗原检测是移植免疫学的重要内容，应用单抗对其进行位点检测可得到更可信的结果。

(3)检测淋巴细胞表面标志

单克隆抗体在理论和实践上的应用成为解决生物学和医学等许多重大问题的重要手段。但是，上述应用的单抗属于鼠源性，鼠源性单抗应用于人类有较强的免疫原性，主要缺陷是诱发人抗鼠抗体（Humananti-mouseantibody,HAMA）反应，大大限制了其临床应用价值。而且，鼠源性抗体在人体内半衰期缩短，生物活性降低。

因此，人们一直致力于人源性抗体的研究。瓶颈以分子生物学技术提取、扩增编码人抗体的DNA，构建质粒，建立组合抗体文库，再利用供者文库建立针对某一特定抗原的子文库。

以该技术制备的抗体片段(Fab)是人源抗体，具有建库简单、抗体表达稳定等特点。迄今已有多种抗体产生。可以预见，该技术具有良好的发展和应用前景。解决方案：（1）如用人脾细胞与鼠骨髓瘤细胞杂交；（2）用EB病毒转化人的B淋巴细胞；（3）用基因工程法制备嵌合抗体等。困难（4）最新方法：——噬菌体技术和转基因鼠技术人源化治疗性单克隆抗体的研究进展构建的基本思路鼠抗体人源化就是通过基因改造，使其和人体内的抗体分子具有极其相似的轮廓，从而逃避人免疫系统的识别，避免诱导HAMA（人抗鼠抗体）反应。对鼠源抗体进行人源化改造时要遵守两个原则，首先要保持抗体的亲和力和特异性，其次要降低或消除抗体的免疫原性。人源化程度1.嵌合抗体（Chimericantibody)用人源基因代替鼠源单抗的恒定区，即该单抗由鼠的可变区和人的恒定区组成的嵌合抗体。由于嵌合抗体可变区（V）约占整个抗体的30%，鼠源性抗体V区中的框架区（FR)仍残留一定的免疫原性，可诱导HAMA反应。灵长目源抗体也是一类嵌合抗体，通过免疫短尾猿猴产生。由于其抗体的可变区与人可变区无差异，不至于发生抗体反应。缺点解决方案2.CDR移植抗体（CDRgraftedantibody)真正意义上的抗体人源化。抗体中除了3个互补决定区（CDR）是鼠源的外，其余全部是人源结构，人源化程度可达到95%以上，具有更高的安全性和更低的毒性。不足有时异基因的CDR人源化抗体可能引起抗个体基因型反应。改良方案——进行SDR移植改良4.全人单克隆抗体（Fullyhumaneantibody)它是将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。

在HIV等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越性。

4.1.抗体库筛选技术4.1.1.噬菌体表面展示技术用PCR技术从人免疫细胞中扩增出整套的抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因，克隆到噬菌体载体上并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面。这样一来噬菌体DNA中有抗体基因的存在，同时在其表面又有抗体分子的表达，就可以方便地利用抗原-抗体特异性结合而筛选出所需要的抗体，并进行克隆扩增。使抗体基因以分泌的方式表达，则可获得可溶性的抗体片段。基本原理和程序

4.3.微胞杂交干细胞技术——日本学者Ishida等首先提出技术要点：

首先将抗G418的人成纤维细胞与小鼠的A9细胞融合，通过筛选，得到抗G418的小鼠A9细胞，再运用PCR或原位荧光杂交方法筛选，先筛选出的细胞用秋水仙素处理48h，然后用细胞松弛素B处理并高速离心，分离出含2号、14号、22号染色体的小鼠。人源抗体在这种转基因小鼠的产量还比较低。4.4.其他方法XTL生物制药公司使用一种类似于人骨髓移植的方法，用放射线破坏动物骨髓，然后注入人抗体生成细胞。该公司已用此法生产出一种全人单抗。应用单克隆抗体后的患者症状改善率总结到目前为止，至少有35个完全人类的单抗已经进入临床的治疗实验阶段。这些单抗的靶抗原都是临床癌疾病自身免疫疾病或炎症疾病和传染病中的主要抗原。例如EGFR/CTLA-4和CD4等。在治疗一些一种移植、骨质疏松症等疾病已有显著的效果。但是，免疫原性仍是存在的问题，因此，利用转基因