单克隆抗体与基因工程抗体制备课件

单克隆抗体与基因工程抗体制备多克隆抗体

(Polyclonalantibody)

概念给动物接种抗原所获得的免疫血清或抗血清，是多种抗体的混合物,它是由多种抗原决定簇刺激多株B细胞增殖分化所产生的，称为多克隆抗体。单克隆抗体

(Monoclonalantibody,McAb)概念:通过B细胞杂交瘤技术,获得特异性针对某一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一性的抗体.特点:针对单一表位结构相同功能均一

杂交瘤技术的理论基础淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆只产生一种抗体细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞，杂交瘤技术流程两种亲本细胞的选择与制备

细胞融合

杂交瘤细胞的筛选与克隆化两种亲本细胞的选择与制备小鼠骨髓瘤细胞免疫脾细胞骨髓瘤细胞系选择要点：稳定易培养、自身不分泌Ig、融合率高、HGPRT缺陷株常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63等。保存：防止突变、定期筛选（8-氮鸟嘌呤）防止支原体污染（胎牛血清）融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95％

用高纯度高活性抗原刺激免疫小鼠免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提供处于增殖状态的特异性B细胞，此时血清中抗体效价不一定最高。可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，

10-15ug/100ul+等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔2-4周后加强免疫（量减半，改用不完全佐剂，可反复多次）。冲击免疫（融合前3天进行）颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果细胞融合当两个细胞紧密接触时，细胞膜可能融合在一起。融合细胞含有两个不同的细胞核，称为异核体，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞（hybridcell）。骨髓瘤细胞

PEG

杂交瘤细胞

脾细胞

细胞融合剂：PEG作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合作用特点：不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同融合后细胞的类型:

未融合的脾细胞（寿命短，5-7天死亡）

杂交瘤细胞（分泌抗体和永生性）

未融合的瘤细胞杂交瘤细胞的筛选与克隆化细胞DNA合成途经1.替代途径：次黄嘌呤（H）HGPRT2.主要途径：氨基酸鸟嘌呤核苷酸谷氨酰胺（A-）尿核苷单磷酸胸腺嘧啶核苷酸TK3.次要途径：胸腺嘧啶核苷（T）HAT选择培养基的原理HAT选择培养基组分次黄嘌呤（hypoxanthine,H)

氨甲喋呤（aminopterin,A):叶酸拮抗剂胸腺嘧啶核苷（thymidine,T)融合后不同细胞在HAT培养基的结果及命运杂交瘤细胞未融合的脾细胞未融合的骨髓瘤细胞脾-脾杂交细胞骨髓瘤-骨髓瘤杂交细胞阳性杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞在HAT中生长，其中仅少数是分泌特异性McAb的细胞，而且有的培养孔生长多个细胞群落，必须筛选。一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10时，开始检测特异性抗体，筛选出所需杂交瘤细胞系。可靠的筛选方法须在融合前建立，避免由于方法不当贻误筛选时机。克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆法阳性杂交瘤细胞的冻存阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及污染配制方案：杂交瘤细胞（（1～5）x106/ml)+细胞冻存液(30%～40%牛血清，50%～60%RPMI-1640培养液，10%DMSO)“慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮

“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、复苏单克隆抗体的制备经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。单克隆抗体的纯化盐析凝胶过滤离子交换层析亲和层析法辛酸沉淀法用中性盐使蛋白质沉淀析出的方法为盐析。大量的盐加入到蛋白溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，可夺取蛋白质的水化层，使蛋白质胶粒失水发生凝聚而沉淀析出。

血清50%饱和度硫酸胺

上清（清蛋白）沉淀（球蛋白）33%饱和度硫酸胺上清沉淀拟球蛋白r球蛋白亲和层析法将抗原（或抗体）连接到固相载体上，特异性吸附液相中的抗体（或抗原），形成抗原抗体复合物，然后改变条件，使抗原抗体复合物解离洗脱出纯化的抗体（或抗原）。单克隆抗体的性质鉴定Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法特异性测定：抗原类似物的交叉反应效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示

表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的,用竞

争抑制法，相加指数法及微机集群分析亲和性测定：测定亲和常数K杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠B细胞染色体40条，SP2/0细胞68条，杂交瘤细胞一般100多条McAb靶抗原分子量：常用westernblot免疫动物培养骨髓瘤细胞

收集致敏的B淋巴细胞收集骨髓瘤细胞

细胞融合

HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞检测筛选阳性细胞

克隆化培养（反复3-5次）

获得稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株

McAb的制备（杂交瘤培养上清或诱生腹水）

McAb纯化及鉴定单克隆抗体特性优点：理化性状高度均一，生物活性专一，只与一种抗原表位发生反应，特异性强，纯度高，易于实验标准化和大量制备缺点：制备复杂，价格昂贵；反应强度不如多克隆抗体；应用有一定的局限性等等

单克隆抗体在医学中的应用检验医学诊断试剂（1）病原微生物抗原抗体的检测（2）肿瘤抗原的检测（3）免疫细胞及其亚群的检测（4）激素测定（5）细胞因子的测定蛋白质的提纯肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术基因工程抗体与抗体库技术单抗体内应用和疗效受限原因：1.鼠源性单抗对人体有较强的免疫原性2.注入人体的单抗在肿瘤部位的摄取量甚少3.生产成本高,难于普及应用人杂交瘤技术未获真正突破原因:融合率低、建株难、不稳定、产量低、人体不能随意免疫新思路：尽量减少抗体中的鼠源成分，但又尽量保留原有的抗体特异性。基因工程抗体：根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体，主要包括嵌合抗体、人源化抗体、小分子抗体、抗体融合蛋白和双特异性抗体。抗体库技术：用细菌克隆取代B细胞克隆表达抗体，不经细胞融合，甚至不经免疫，制备针对任何抗原的单克隆抗体。嵌合抗体(chimericantibody)从杂交瘤细胞分离出功能性