生物化学实验deae纤维素离子交换

综合实验（第二次）

DEAE-纤维素离子交换层析与活力测定及蛋白定量生化教研室蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化是对蛋白质进行研究的一项必需的和基础的工作。目前常使用的分离纯化的方法或技术都是在了解蛋白质性质和结构特点的基础上建立的。

目标蛋白质的分离纯化程序主要包括⑴材料的选择；⑵组织匀浆和破碎细胞获取粗提取液；⑶蛋白质初步提纯；⑷选择一种或几种合适的方法除去杂蛋白,直至完全纯化；⑸目标蛋白的鉴定。用于研究目的蛋白质通常应保持它的生物活性较低温度下(0－4℃)操作，注意使用蛋白酶(使蛋白质降解的酶)的抑制剂，避免使用剧烈条件，以免蛋白质特定的折叠结构受到破坏。综合实验内容第一部分：（上周）经G-25层析除盐得到α1-AT粗提样品第二部分：（本周）采用DEAE-纤维素离子交换层析纯化粗提α1-AT

第三部分：（下周）采用SDS电泳鉴定纯化得到的粗提和精提蛋白质第二部分DEAE-纤维素离子交换层析（IonExchangeChromatography,IEC）及活力测定、蛋白定量DEAE:二乙基氨基乙基本次实验目的1、提纯上次实验得到的粗提液，以获得高纯度蛋白2、掌握DEAE-纤维素离子交换层析原理与实验操作技术3、通过检测α1-AT对胰蛋白酶的抑制力来测定α1-AT的活力根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法。

以离子交换剂为固定相，特定的离子溶液为流动相，依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同进行分离纯化的层析方式。离子交换层析（IonExchangeChromatography,IEC）的基本原理原理DEAE-cellulose是应用最广的阴离子交换剂，本身带有正电荷，能吸附溶液中的阴离子。当使用含有“-”的溶液洗柱时，含“-”少的首先被洗脱下来（球蛋白表面带的“-”少）当增加“-”浓度时，含“-”多的后被洗脱本实验用DEAE-纤维素，以除去样品中的大部分球蛋白亲和力大的先被交换上去,后被洗脱下来.A+BABAB柱层析离子交换层析法将交换上去的离子，用适当的洗脱剂依次洗脱而分离.树脂－O—N+(CH3)2

—OH-离子交换剂离子交换剂由基质、电荷基团（或称功能基团）和反离子组成。基质一般是不溶性聚合物，如纤维素，交联葡聚糖，交联琼脂糖等；

纤维素－O—CH2—COO-—Na＋基质电荷基团反离子阳离子交换剂阴离子交换剂离子交换剂的选择考虑因素：

1.被分离物质带何种电荷2.被分离物质分子的大小大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素3.被分离物质所处的环境4.被分离物质的物理化学性质5.被分离物质的大概数量对于两性蛋白而言，结合力取决于其等电点以及溶液的pH值。（蛋白质由氨基酸组成，是一种两性电解质，在一定pH条件下可带电荷）cationzwitterionanion+H++H+R—CH—COOH|NH3+R—CH—COO-|NH3+R—CH—COO-|NH2-H+-H+A+A0A-pH<pIpH=pIpH>pI起始缓冲液的选择原则：不能与样品发生化学反应，避免使样品变性。其pH值和离子强度等能使样品中有效成分与离子交换剂结合，而不能使样品中杂质与离子交换剂结合。洗脱液指一定离子强度与一定pH值的缓冲溶液洗脱方法：改变洗脱液的离子强度增强洗脱液与离子交换剂的结合力改变洗脱液的pH降低待分离物与离子交换剂的结合力洗脱方式：阶段洗脱法梯度洗脱法人血浆蛋白质的等电点及分子量蛋白质等电点分子量清蛋白4.8869000α1-球蛋白5.06200000α2-球蛋白5.06300000β-球蛋白5.129000-150000γ-球蛋白6.85-7.50156000-3000000.05mol/LPBS缓冲液（pH6.4）血清蛋白质中α1-球蛋白α2-球蛋白β-球蛋白在pH高于它们pI的缓冲液中则带“-”实验原理采用DEAE-纤维素离子交换层析纯化蛋白。洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.4）。在此pH与离子强度时，DEAE-纤维素带有正电荷，能吸附带负电荷的蛋白质如白蛋白（pI4.9）带正电荷蛋白质如γ-球蛋白（pI约7.3），不被吸附故直接流出。用0.03mol/L磷酸盐缓冲液洗脱吸附在离子交换柱上的少量β-球蛋白及α-球蛋白。将磷酸盐浓度提高至0.12mol/L，白蛋白被洗脱下来（作为精制提取蛋白）。材料与试剂1、主要材料层析柱（1.6×20cm）、固定架、离心管（不同规格）2、主要试剂

0.05mol/LPBS（pH6.4）0.12mol/LPBS（pH6.4）DEAE-cellulose3、样品：经G-25凝胶层析除盐的α1-AT粗提液实验步骤DEAE—纤维素层析柱的准备

（1）酸碱处理：DEAE-纤维素可按0.5mol/LNaOH→0.5mol/LHCl→0.5mol/LNaOH（碱→酸→碱）程序处理。（2）装柱：DEAE纤维素用0.05mol/LPBS（pH6.4）浸泡后装柱，柱床体积约1.6cm×6cm装柱时应注意装柱均匀，柱床内不得有界面、气泡，表面要平整。（3）平衡：装柱后接上恒压贮液瓶，用0.06mol/LPBS（pH6.4）洗涤平衡，流速15d/min。

2、DEAE—纤维素层析纯化白蛋白1）上样：将剩余（留取2ml用作下次实验）样品贴壁旋转加入上述已平衡好的层析柱表面，使样品进入柱床内。小心用PBS洗涤沾在管壁上的蛋白质样品，使其进入床内。2）洗脱：首先用0.05mol/LPBS洗脱，用双缩脲试剂检查洗脱液，出现紫红，为第一峰蛋白，直至无紫色（即无蛋白）则停止收集。第二3）白蛋白的纯化：改用0.12mol/LPBS缓冲液（pH6.4）洗脱。每管1ml分部收集(调节部分收集器时间为1min/tube)。合并蛋白质浓度高的2-3管，用于后续蛋白质纯度鉴定。由于纯化的白蛋白仍然结合有少量胆色素等物质，收集的蛋白质为肉眼可见的浅黄色液体。4）再生平衡：改用

1.5mol/LNaCl—0.3mol/LNH4Ac缓冲液洗脱，至记录仪基线基本恢复到原始位置后，再用40ml0.06mol/LNH4Ac（pH6.5）洗脱平衡即可。Samplediagramofagelfiltrationsystemwithgravityfeed.Thesafetyloopisdesignedtokeepthecolumnfromrunningdryifleftunattended.SafetyloopBSZ-100自动部份收集器结构与使用方法按“复位”键，仪器自动复位至起点后“报警”，再按“复位”键，仪器自动复位。设置定时时间：（1）按下“手动/自动”键，使仪器处于“手动”状态。（2）按“选择”键，设定时间为1min。自动收集按“手动／自动”键，指示灯亮，仪器处于自动收集状态。HD-3紫外检测仪使用方法将波长旋钮旋到280nm.按下“电源”开关。调节“灵敏度”旋钮至“100％”档，调节“光量”旋钮，使检测仪数字显示50左右进行仪器预热。开启高位槽，使层析柱缓冲液流过检测仪。在“灵敏度”旋钮处于“100％”档时，调节“光量”旋钮，使检测仪数字显示为100，即透光率为100％。把“灵敏度”旋到所需档（1A），调节“调零”旋钮，使检测仪数字显示为“0”。在样品检测过程中，不可再调节“调零”、“光量”旋钮。如绘出的图谱即出峰过小，可改变“灵敏度”选择档，每档成两倍放大关系。

LM17型记录仪使用说明1.打开电源开关。2.调节零位：按“量程/零位”切换按键，当“零位”指示灯亮时，数码管显示为“Po”。在零位调节状态下，按下“左移”或“右移”按键不放，使记录笔移至所需的零位。3.选择量程：按“量程/零位”切换按键，当“量程”指示灯亮时，表示当前操作为量程选择，按[增加]或[减少]键，选取合适的量程（HD-3紫外检测仪的量程为10mV）。4.取下记录笔的塑料笔套，压下“抬/落笔手柄”（不要强力按压笔尖，以避免笔尖损坏或变粗）。实验结束后，将塑料笔套套上，以避免墨水蒸发。5.选择走纸速度：按“启/停”切换按键，当纸速显示数码管闪烁时，此时按“调速”键调节选择走纸的速度。每按一下，数字依次在0.1mm/min至600mm/min之间变化。调节走纸速度为2mm/min，按“启/停”键，数码管不再闪烁时，仪器即开始记录。不记录时按“启/停”键，数码管闪烁，表示停止走纸。量程/零位切换键量程显示减少/左移键增加/右移键状态指示灯电源指示灯盒式纤维笔纸速显示调速启停抬落笔手柄电源开关走纸手轮记录紫外检测仪所显示的峰值，在洗脱曲线上标示出所更换的溶液、峰值