氨基酸薄层层析

氨基酸薄层层析第1页/共28页如何分离鉴定氨基酸混合液？生物化学与分子生物学实验教学中心第2页/共28页氨基酸的薄层层析

(Thinlayerchromatographyofaminoacids)

第3页/共28页实验目的掌握薄层层析法的一般原理。掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。掌握如何根据移动速率（Rf值）来鉴定被分离的物质（即氨基酸混合液）。第4页/共28页层析基本概念层析技术是利用化合物中各组分的物理性质（如溶解度、吸附能力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分不同程度地分布在两相中，随着流动相从固定相上流过，不同组分以不同速度而最终被分离。特点：分离效率高，能分离各种性质相类似的物质。不仅可用于少量物质的分离纯化，也可用于大量物质的分离纯化和制备。第5页/共28页层析基本概念固定相：固定相是层析的一个基质。包括固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等）和液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些物质能与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶解和交换作用。流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。第6页/共28页层析技术的分类（1）按两相所处状态，可分为液相层析和气相层析，前者以液体为流动相，后者以气体为流动相。（2）按操作形式不同，可分为柱层析、薄层层析和纸层析。（3）按层析的原理不同，可分为吸附层析、分配层析、凝胶层析、离子交换层析和亲和层析等。今天要做的试验，根据原理属于吸附层析，根据操作形式又属于薄层层析，合到一起叫：吸附薄层层析。第7页/共28页硅胶薄层层析第8页/共28页实验原理

1.薄层层析法是色谱分析技术的一种

一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。（即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来）第9页/共28页硅胶吸附薄层层析实验原理吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶

硅胶：表达式为SiO2·XH2O。层析用硅胶是一种多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性硅醇基（－Si－OH），这种极性的硅醇基能和许多化合物形成氢键而产生吸附.第10页/共28页实验原理硅胶吸附薄层层析的特点：

①硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活性也与含水量呈负性相关。②硅醇基显较弱的酸性，因而，硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离。③硅胶的活化温度通常为105℃－110℃，不能过高。第11页/共28页实验原理

2.氨基酸与茚三酮的显色反应

茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。第12页/共28页实验原理3.混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置用相对迁移率—Rf值（rateofflow）来表示。

层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。第13页/共28页实验材料吸附剂：硅胶粘合剂：0.5%的羧甲基纤维素钠氨基酸的异丙醇溶液

丙氨酸、精氨酸、甘氨酸展开-显色剂（正丁醇、乙酸、茚三酮溶液）分析样品：氨基酸混合液第14页/共28页器材层析板、尺子、铅笔烧杯、玻棒、量筒吹风机毛细管、层析缸药匙烘箱第15页/共28页薄层层析装置第16页/共28页操作步骤—薄层板的制备

1、调浆称取硅胶3克，加0.5%的羧甲基纤维素钠8毫升，调成均匀的糊状。

2、涂布取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。

3、干燥将玻璃板水平放置，室温下自然凉干。

4、活化

70℃烘干30分钟。切断电源，待玻璃板面温度下降至不烫手时取出。第17页/共28页层析板制备第18页/共28页2cm1cm1、位置：用铅笔距底边2cm水平线上均匀确定4个点。每个样品间相距约1cm。2、取样：用毛细管分别吸取氨基酸溶液，取样量为毛细管柱高5cm。3、点样：点样毛细管轻轻接触薄层表面点样。加样后原点扩散直径不超过2mm。

AlaArgGlyMix轻触疾起操作步骤—点样第19页/共28页点样操作第20页/共28页操作步骤—

展层、显色AlaArgGlyMix

将薄层板点样端浸入展层-显色剂，展层-显色剂液面应低于点样线。盖好层析缸盖，上行展层。当展层剂前沿离薄板顶端2cm时，停止展层，取出薄板，用铅笔描出溶剂前沿界线，用热风吹干或在85℃下烘干，即可显出各层斑点。第21页/共28页试样展开过程第22页/共28页结果计算Rf=斑点至原点距离溶剂前缘至原点距离

小心量出斑点中心至原点中心距离，再量出原点中心至溶剂前沿的距离，计算出它们的Ｒｆ值。

根据Ｒｆ值，鉴定出混合样品中氨基酸的种类，并绘出层析图谱。第23页/共28页Rf值测量第24页/共28页数据处理样品ArgGlyAla混合液斑点-原点溶剂前缘-原点Rf值第25页/共28页注意事项1.切勿用手直接接触薄层板面。2.点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴。3.样