第一节植物细胞工程

第一节植物细胞工程第1页，共28页，2023年，2月20日，星期一一、细胞工程简介指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过某种工程学手段，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。细胞工程内容植物细胞工程动物细胞工程植物组织培养植物体细胞杂交应用的原理和方法：细胞生物学和分子生物学研究的水平：细胞整体水平或细胞器水平研究的目的：按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质

或获得细胞产品(定向改造）所采用技术的理论基础：植物细胞的全能性植物细胞工程技术：植物组织培养、植物体细胞杂交第2页，共28页，2023年，2月20日，星期一二、植物细胞工程的发展历史１、探索阶段(20世纪初至30年代中)1902年，德国植物学家Haberlandt提出了植物细胞全能性学说。植物的器官和组织可以不断分割，直至分到单个细胞而不影响细胞增殖的观点。并设想离体细胞具有再生完整植株的潜力。第3页，共28页，2023年，2月20日，星期一二、植物细胞工程的发展历史2、培养技术建立阶段（20世纪30年代至50年代末）作为一门技术，必须具有一定的程序性（技术模式）。在这一阶段植物组织培养建立了2个与培养技术有关的重要模式：培养基模式、激素调控模式。1934年美国的White，利用番茄根建立了第一个活跃生长的无性繁殖系，发现B族维生素对培养的离体根生长具有重要作用，创立了White培养基。1943年White发表了《植物组织培养手册》的专著，使植物组织培养开始成为一门新兴的学科。1948年，Skoog和崔徵通过对烟草茎切段和髓培养组织的研究，确定了腺嘌呤／生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。1956年Miller等发现了激动素。控制器官分化的激素模式变为激动素／生长素的比例关系，促进组培发展。第4页，共28页，2023年，2月20日，星期一1958年，英国科学家Steward等用胡萝卜根的愈伤组织细胞进行悬浮培养，成功诱导出胚状体并分化为完整的小植株，首次获得植株再生成功。使细胞全能性理论得到证实，这是植物组培的第一次突破。2、培养技术建立阶段（20世纪30年代至50年代末）二、植物细胞工程的发展历史1960年，Cocking等用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得成功。这是植物组织培养的第二次突破。1960年G.Morel采用兰花的茎尖培养，实现了去病毒和快速繁殖两个目的。Morel提出的这种离体无性繁殖方法，其繁殖系数极高，很快被兰花生产者所采用，迅速建立起兰花工业。植物离体微繁技术及脱毒技术得到了迅速发展，实现了产业化。第5页，共28页，2023年，2月20日，星期一2、培养技术建立阶段（20世纪30年代至50年代末）二、植物细胞工程的发展历史1962年Marshing和Skoog在烟草培养中筛选出至今仍被广泛使用的MS培养基。1964年，印度科学家Guha和Maheswari在曼陀罗花药培养中首次由花粉诱导得到了单倍体植株。3、应用研究阶段（20世纪70年代以后）1971年，Takebe等从烟草原生质体得到再生植株，首次获得原生质体植株再生成功。

1972年，Carlson等通过两个烟草物种之间原生质体的融合，获得了第一个体细胞杂种植株。（1）原生质体培养取得重大突破（2）花药培养取得显著成绩（3）微繁技术广泛应用第6页，共28页，2023年，2月20日，星期一三、植物组织培养1、定义:已高度分化的细胞仍具有发育成完整个体的潜能。2、原因:生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。3、差异:⑴受精卵的全能性最高⑵受精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的低。

4、大小：受精卵＞生殖细胞＞体细胞;植物细胞＞动物细胞5、潜在全能性的原因:基因的选择性表达细胞的全能性指的是什么?思考讨论：为什么体内细胞没有表现出全能性，而是分化成为不同的组织、器官？基因在特定空间和时间条件下选择性表达的结果。在个体发育的不同时期，生物体不同部位的细胞的基因表达不同的，合成的蛋白质也不一样，从而形成了不同的组织和器官。植物组织培养原理：细胞的全能性第7页，共28页，2023年，2月20日，星期一植物激素：细胞分裂素、生长素植物组织培养条件：内因：处于离体细胞、组织或器官外因：培养基(在一定的营养物质如：无机盐、蔗糖、氨基酸和有机酸等、激素如：如细胞分裂素、生长素等和适宜的外界条件如：适宜的温度、PH、光照、无菌等。

三、植物组织培养离体的植物器官/组织/细胞/原生质体外植体植物体胚状体、丛芽再分化光愈伤组织脱分化避光植物组织培养技术的流程简图细胞脱分化：就是让已经分化的细胞．经过诱导后，失去其特有的结构和功能而转变成未分化细胞的过程，在植物中，一些分化的细胞，经过激素的诱导，可以脱分化为具有分生能力的薄壁细胞，进而形成植物的愈伤组织(在一定的培养条件下，又可以再分化出幼根和芽，形成完整的小植株)。脱分化当生长素含量高于细胞分裂素时，主要诱导植物组织脱分化和根原基的形成，而当细胞分裂素的效应高于生长素时，则主要诱导植物组织再分化和芽原基的形成。另外，植袖生长调节剂在培养基中的用量要考虑组织内源激素的含量，准确把握它与外源激素的协同作用。第8页，共28页，2023年，2月20日，星期一三、植物组织培养阅读实验完成P36讨论1.在组织培养实验中，为什么要强调所用器械的灭菌和实验人员的无菌操作？植物组织培养中用到的培养基含有丰富的营养成分，有利于培养物的生长，然而各种杂菌同样也可以在上面迅速生长，所以植物组织培养过程中污染现象经常发生。培养基一旦被污染，迅速生长的各种杂菌不但会和培养物争夺营养，而且这些杂菌生长的过程中会生成大量对培养物有害的物质，导致培养物迅速死亡。造成培养基污染的因素有很多，一般包括：外植体带菌、培养瓶和各种器械灭菌不彻底、操作人员操作不规范等。所以在组织培养实验中用到的植物材料和各种器械都要进行彻底地灭菌，实验人员操作一定要规范，避免带入杂菌。第9页，共28页，2023年，2月20日，星期一

三、植物组织培养阅读实验完成P36讨论2.在本实验中，切取胡萝卜块根时强调要切取含有形成层部分，原因是这部分容易诱导形成愈伤组织。请思考一下，胡萝卜的其他部分（如茎、叶、花），是否也能培养成小植株，你能用实验的方法进行验证吗？胡萝卜的其他部分（如茎、叶、花）也能培养再生形成小植株，只是诱导愈伤组织比较困难。可以让学生参考利用胡萝卜根进行组织培养的实验，尝试设计出利用胡萝卜的茎、叶、花进行组织培养的实验流程。第10页，共28页，2023年，2月20日，星期一三、植物组织培养阅读实验完成P36讨论3.请根据上面的实验过程，概括出植物组织培养技术的流程简图。植物材料消毒诱导出愈伤组织接种到诱导培养基愈伤组织接种到分化培养基上可以不继代培养直接诱导分化得到大量的愈伤组织愈伤组织转接到继代培养基上分化出幼苗完整植株诱导幼苗与生根同时实现，可省略生根培养基移栽到大田幼苗接种到生根培养基上第11页，共28页，2023年，2月20日，星期一三、植物组织培养植物组织培养就是在无菌和人工控制条件下将离体的植物器官、织组、细胞，培养在人工配制的培养基上给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。植物组织培养定义第12页，共28页，2023年，2月20日，星期一四、植物体细胞杂交技术这幅番茄—马铃薯图利用传统有性杂交方法能实现吗？为什么？因为不同种生物之间存在着生殖隔离，所以用传统的有性杂交方法是不可能做到这一点的。1978年梅尔彻斯(Melchers)等首次获得了番茄和马铃薯的属间体细胞杂种——“Potamato”。第13页，共28页，2023年，2月20日，星期一再生出细胞壁杂种细胞植物细胞A植物细胞融合植物细胞B纤维素酶酶解法果胶酶去细胞壁原生质体A原生质体B物理方法化学方法：离心振动电刺激人工诱导聚乙二醇(PEG)原生质体融合正在融合的原生质体愈伤组织再生小植株杂种植株植物细胞杂交流程四、植物体细胞杂交技术第14页，共28页，2023年，2月20日，星期一定义：植物体细胞杂交就是将不同种的植物体细胞在一定条件下融台成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。优势（与有性杂交方法比较）：打破了不同种生物间的生殖隔离限制，大大扩展了可用于杂交的亲本组合范围。成果：克服不同生物远缘杂交的障碍，出现自然界没有的新品种。目前，已得到栽培烟草与野生烟草、栽培大豆与野生大豆、籼稻与野生稻、籼稻与粳稻、小麦与鹅冠草等细胞杂种及其后代，获得了有价值的新品系或育种上有用的新材料。未解决问题：尚未让杂种植物按照人们的需要表现出亲代的优良性状。四、植物体细胞杂交技术第15页，共28页，2023年，2月20日，星期一自然界中有一种含有叶绿体的原生动物──眼虫，说明植物的细胞器同样可以在某些动物细胞中存活，请探讨：动物细胞与植物细胞之间能实现杂交吗？如果理论上可行，请设计出具体实验方案。四、植物体细胞杂交技术思考与讨论：细胞壁如何去除？原生质层如何融合？融合的基础是什么？杂交完成的标志是什么？最后通过什么手段得到新个体？为什么“番茄—马铃薯”超级杂种植株没有如科学家所想像的那样，地上长番茄、地下结马铃薯？马铃薯—番茄没有像人们预想的那样地上长番茄、地下结马铃薯，主要原因是：生物基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，所以马铃薯—番茄杂交植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达受到相互干扰，不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达，杂交植株不能地上长番茄、地下结马铃薯就是很自然的了。第16页，共28页，2023年，2月20日，星期一项目传统杂交细胞杂交依据杂种优势细胞全能性、原生质体融合过程自然发生，在母体完成胚发育人工诱导融合，需组织培养本质精、卵两种生殖细胞结合，完成遗传物质的重新组合不同生物的体细胞融合和完成遗传物质的融合优点杂种第一代生长整齐、植株健壮、产量高、抗虫抗病能力强克服远源杂交不亲和障碍，实现不同种间的杂交缺点存在生殖隔离；杂种第二代出现生长不齐、产量下降等现象很多理论、技术问题未解决，距离推广应用有一定差距目的获得杂种优势，提高产量获得杂种植株，优良性状意义自然发生、方便生产扩展了用于杂交的亲本组合应用范围种内种内、种间均可四、植物体细胞杂交技术植物细胞杂交与传统细胞杂交比较第17页，共28页，2023年，2月20日，星期一（一）、植物繁殖的新途径五、植物细胞工程的实际应用1.微型繁殖(属无性繁殖)(1)微型繁殖技术（快速繁殖技术）:速繁殖优良品种的植物组织培养技术.(2)特点:保持优良品种的遗传特性;高效快速地实现种苗的大量繁殖.

人们利用植物的微型繁殖技术来进行工厂化育苗生产，这是利用了该项技术的哪些特点？植物“微型”繁殖技术具有高效性和可以保持种苗的优良遗传特性的优势。工厂化大规模育苗生产正是利用了植物“微型”繁殖技术的这两方面优势。利用植物“微型”繁殖技术我们可以在短时间中获得大量的优质种苗。第18页，共28页，2023年，2月20日，星期一（一）、植物繁殖的新途径五、植物细胞工程的实际应用2.培育脱毒作物

(1)材料:无病毒的茎尖

(2)脱毒苗:切取茎尖进行组织培养获得第19页，共28页，2023年，2月20日，星期一

人工种子之所以神奇，是由于它具有天然种子不可比拟的特点，想一想它们具有哪些优点？（1）天然种子由于在遗传上具有因减数分裂引起的重组现象，因而会造成某些遗传性状的改变；天然种子在生产上受季节限制，一般每年只繁殖1～2次，有些甚至十几年才繁殖一次。而人工种子则可以完全保持优良品种的遗传特性，生产上也不受季节的限制。（2）试管苗的大量贮藏和运输也是相当困难的。人工种子则克服了这些缺点，人工种子外层是起保护作用的薄膜，类似天然种子的种皮，因此，可以很方便地贮藏和运输。3、人工种子1)、用人工种皮包被体细胞胚(P39)，可以制造人工种子2)、人工种皮：藻酸钠3)、解决有些植物结子困难、发芽率低、繁殖困难等问题（一）、植物繁殖的新途径五、植物细胞工程的实际应用第20页，共28页，2023年，2月20日，星期一（二）、作物新品种的培育五、植物细胞工程的实际应用1.单倍体育种一般要经过5～6年的连续续筛选。而单倍体育种则是通过花药培养获得单倍体植株，染色体加倍后当年便可得到稳定遗传的优良品种，这样就极大地缩短了育种的年限，节约了大量的人力物力。2.突变体的利用

指从产生突变的个体中可以筛选出对人们有用的突变体，进而培育成新品种。（三）、细胞产物的工厂化生产

工厂化生产人参皂甙的基本过程是什么？第一步，选择人参根作为外植体进行培养，产生愈伤组织，经过培养选择找到增殖速度快而且细胞内人参皂甙含量高的细胞株作为种质，其中一部分作为保存用，以备下一次生产用，一部分进行发酵生产。第21页，共28页，2023年，2月20日，星期一五、植物细胞工程的实际应用（三）、细胞产物的工厂化生产

工厂化生产人参皂甙的基本过程是什么？

第一步第二步，将第一步选择到的细胞株在发酵罐中的适合培养液中进行液体培养，增加细胞数量。第三步，将发酵罐中培养的细胞进行破碎，从中提取人参皂甙。第22页，共28页，2023年，2月20日，星期一六、随堂练习1.对细胞全能性的表述正确的是（）

A.非离体植物细胞能够表现出全能性

B.动物细胞融合标志着动物细胞全能性的实现

C.单克隆抗体的制备原理依据是细胞的全能性

D.花粉培育成单倍体是细胞全能性的体现2.植物细胞表现出全能性的必要条件是（）

A.给予适宜的营养和外界条件

B.脱离母体后，给予适宜的营养和外界条件

C.导入其他植物细胞的基因

D.将成熟筛管的细胞核移植到去核的卵细胞内3.在生物体的所有细胞中，全能性最高的是（）

A．卵细胞B植物花粉C．体细胞D.受精卵DDB第23页，共28页，2023年，2月20日，星期一六、随堂练习4.在生物体内，细胞没有表现出全能性，而是分化为不同的组织、器官，是因为（）

A.细胞丧失了全能性

B.基因的表达有选择性

C.不同的细胞内基因不完全相同

D.在个体发育的不同时期，细胞内的基因发生了变化5.植物组织培养依据的原理、培养过程的顺序及诱导的植物激素分别是（）①细胞的全能性②离体植物器官，组织或细胞③根，芽④生长素和细胞分裂素⑤生长素和乙烯⑥愈伤组织⑦再分化⑧脱分化⑨植物体

A．①②⑧⑥⑦③⑨和④

B．①②⑦⑥⑧③⑨和⑤

C．①⑥②⑨⑧③⑦和⑤BA第24页，共28页，2023年，2月20日，星期一六、随堂练习6.植物组织培养可以形成愈伤组织，下列有关愈伤组织的叙述错误的是（）

A.愈伤组织是离体细胞经过脱分化形成的

B.形成愈伤组织的培养基不需含有机分子

C.愈伤组织可以形成具有生根能力的胚状结构

D.愈伤组织细胞的线粒体和核糖体可能发生碱基互补配对7.能刺激愈伤组织形成的诱导剂是（）

A.细胞分裂素和生长素B.赤霉素

C.生长素和赤霉素D.细胞分裂素和乙烯8.将胡萝卜韧皮部细胞培养成幼苗时，下列条件中不需要的是（）

A、具有完整细胞核的细胞

B、一定的营养物质和植物激素

C、离体状态D、导入指定基因BAD第25页，共28页，2023年，2月20日，星期一六、随堂练习9.植物体细胞杂交的目的是（）

A.用酶解法去掉细胞壁分离出有活力的原生质体

B.