第七单元超敏反应性疾病的免疫学检测

第七单元超敏反应性疾病的免疫学检测第1页，共64页，2023年，2月20日，星期一实验一血清IgE的检测第2页，共64页，2023年，2月20日，星期一一、血清总IgE的检测实验目的1.掌握ELISA双抗体夹心法测定血清总IgE的方法。2.熟悉IgE在I型超敏反应中的作用和临床意义。第3页，共64页，2023年，2月20日，星期一EEEE洗涤待测抗原包被抗体酶标抗体实验原理ELISA双抗体夹心法第4页，共64页，2023年，2月20日，星期一实验材料1.羊抗人IgE抗体、HRP标记的羊抗人IgE抗体、IgE校准品、TMB（四甲基联苯胺）。2.标本：待测血清。3.包被缓冲液、洗涤缓冲液、反应终止液（2mol/LH2SO4）等。4.酶标板、微量加样器、酶标仪、温箱等。第5页，共64页，2023年，2月20日，星期一1.包被羊抗人IgE抗体

（4℃过夜，洗涤）

2.封闭（0.5%的小牛血清或牛血清清蛋白）3.加样（梯度稀释的IgE校准品、待测血清、阳性对照、阴性对照、空白对照

）

4.37℃温育2h，洗涤5.加入工作浓度的HRP标记的羊抗人IgE

6.37℃温育2h，洗涤

EEEE操作步骤第6页，共64页，2023年，2月20日，星期一8.加入终止液，终止反应

9.492nm波长测各孔吸光度值（A值）7.加入底物，37℃温育15分钟第7页，共64页，2023年，2月20日，星期一注意事项1.包被抗体量、酶标抗体的加入量等可影响测定结果，需预先摸索最佳条件。2.洗涤要彻底，必要时可加大洗涤液的浓度。3.结果判断须在10分钟内完成。4.IgE含量与吸光度值在一定范围内呈线性关系，如果样品的测定结果超出此范围，应对样品进行适当的稀释，使样品中IgE的浓度在线性范围内再行测定。第8页，共64页，2023年，2月20日，星期一结果分析

以IgE校准品的参考含量（IU/ml）为横坐标，以对应A值为纵坐标，绘制标准曲线。根据待测样品的A值，在标准曲线中查出稀释后样品中IgE的浓度，再乘以稀释倍数，即为原样品中IgE的浓度。1IU=2.4ng。第9页，共64页，2023年，2月20日，星期一临床意义

血清总IgE水平一般用国际单位（IU）或ng表示，1IU＝2.4ng，相当于WHO标准冻干血清制剂0.00928mg内所含的IgE量。正常人群IgE水平受环境、种族、遗传、年龄、检测方法及取样标准等因素的影响，以致各家报道的正常值相差甚远。婴儿脐带血IgE水平小于0.5IU/ml，出生后随年龄增长而逐渐升高，12岁时达成人水平。成人血清IgE水平约在20～200IU/ml之间，一般认为大于333IU/ml（800ng/ml）时为异常升高。IgE升高相关的常见疾病有：过敏性哮喘、季节性过敏性鼻炎、特应性皮炎、药物性间质性肺炎、支气管肺曲菌病、麻风、类天疱疮及某些寄生虫感染等。上述疾病时IgE升高的程度并不一致，在过敏性支气管肺曲菌病时最为显著，其值可达5000～20000ng/ml，除了此病和特应性皮炎以及在花粉季节之外，任何血清总IgE水平大于5000ng/ml的患者均应考虑寄生虫感染的可能性。第10页，共64页，2023年，2月20日，星期一

思考题1.ELISA双抗体夹心法定量测定血清总IgE的原理及应注意的问题有哪些？2.测定血清总IgE的临床意义？第11页，共64页，2023年，2月20日，星期一二、血清特异性IgE的检测实验目的1.掌握斑点酶免疫印迹法检测sIgE的原理和方法。2.熟悉sIgE在I型超敏反应中的作用和临床意义。第12页，共64页，2023年，2月20日，星期一

实验原理

斑点酶免疫印迹法：用NC膜作为固相支持物，检测区的不同区域包被有特异性的过敏原，质控区包被有兔抗鼠Ig抗体。检测时将稀释的病人血清加入反应槽内，血清中的sIgE与NC膜上的相应过敏原结合。通过洗涤去掉未结合的游离物质，再加入酶标记的抗人IgE抗体，此抗体会与检测区NC膜上的sIgE结合，同时会与质控区上的兔抗鼠Ig抗体结合。如标本中无sIgE，酶标抗体不能结合在检测区相应过敏原区带上。通过洗涤去掉未结合的标记物，然后加入底物显色。通过显色区带确定血清中含有哪种sIgE，进而判断待检者对哪种过敏原过敏。第13页，共64页，2023年，2月20日，星期一第14页，共64页，2023年，2月20日，星期一实验材料1.检测条包被有特异性过敏原的NC膜2.碱性磷酸酶标记的抗人IgE3.标本稀释液4.碱性磷酸酶底物5.浓缩洗液（10X）洗液按照1:10倍稀释6.标本待测血清用标本稀释液按照1:10倍稀释。第15页，共64页，2023年，2月20日，星期一稀释好的洗液将检测条要充分浸透，放在摇床上摇10分钟倒掉洗液，加入稀释好的测试者血清，放于摇床室温反应1.5小时倒掉小槽中的血清，依次加入洗液，震荡10分钟，重复三次

每槽加入碱性磷酸酶标记的抗人IgE，放于摇床上室温反应30分钟将碱性磷酸酶标记的抗人IgE倒掉，用洗液洗三次，每次10分钟

加入碱性磷酸酶底物，放于摇床，避光反应约10分钟去掉底物溶液，用纯水洗三次，每次5分钟操作步骤将检测条放在干燥纸上，等检测条完全干燥后判定检测结果第16页，共64页，2023年，2月20日，星期一

注意事项1.不同批次的组分不可混用，且只能在效期内使用。2.检测标本只限于人血清、血浆。3.如果样本在3天内检测，可以保存在2~8℃，否则应冷冻保存，避免反复冻溶。4.如果标本含有不溶物，离心去除。溶血、浑浊或含有叠氮钠的标本不可用。5.加样器枪头不可混用，避免交叉污染。第17页，共64页，2023年，2月20日，星期一结果分析通过显色区带确定血清中含有哪种sIgE，进而判断待检者对哪种过敏原过敏。临床意义

slgE测定是体外检测变应原的重要手段，主要用于Ⅰ型超敏反应的诊断。该检测条包被有多种特异性过敏原，通过检测血浆（血清）中过敏原slgE，筛查待检者对何种过敏原过敏，为临床进行脱敏治疗奠定基础。第18页，共64页，2023年，2月20日，星期一小结和讨论1.人类I型超敏反应可表现为全身性超敏反应和局部性超敏反应两种。

2.在5类免疫球蛋白中，IgE是血清中含量最低，半衰期最短，分解率最高，对热最不稳定的Ig。而在I型超敏反应患者体内，IgE含量显著增高。

3.血清总IgE的含量是由各种抗原IgE的总和决定。正常人血清IgE含量极微，约0.1～0.9mg/L水平。临床上一般采用敏感性较高、稳定性较好的化学发光免疫测定法、酶联免疫测定法进行检测。

第19页，共64页，2023年，2月20日，星期一

思考题1.测定血清sIgE的方法有哪些？各有何优缺点？2.测定血清sIgE的临床意义？第20页，共64页，2023年，2月20日，星期一实验二红细胞表面不完全抗体的检测第21页，共64页，2023年，2月20日，星期一一、直接Coombs试验（试管法

）

实验目的1.掌握直接Coombs试验的原理和操作方法。2.熟悉Coombs试验的临床意义。第22页，共64页，2023年，2月20日，星期一＋患者红细胞Coombs试剂检测红细胞上不完全抗体实验原理第23页，共64页，2023年，2月20日，星期一

实验材料1.诊断试剂抗球蛋白试剂；2.待测患者红细胞；3.生理盐水、小试管、吸管、离心机等。第24页，共64页，2023年，2月20日，星期一操作步骤用生理盐水配5%红细胞悬液取洁净小试管2支，1管加1滴5%红细胞悬液，另一管加生理盐水作对照

在生理盐水和5%红细胞悬液中分别加入诊断试剂一滴，使其混匀，室温稍待片刻1000r离心1min或3000r离心15s。

取出试管先以肉眼观察有无溶血，再轻轻摇动试管，如有凝集，则为阳性结果；如无凝集，应在室温延长15~30min的反应时间，再离心看结果。第25页，共64页，2023年，2月20日，星期一注意事项1.每次试验均须设阴、阳性对照，如阴性对照发生自凝，实验无效。2.受检血标本必须新鲜。3.洗涤后的红细胞和器材都不能残留有血浆蛋白，以免出现假阴性。4.操作过程中动作轻柔，特别是观察反应结果时，应轻轻摇动试管，不可用力过大。5.判定结果时，溶血与凝集有同样意义。6.试验后应将玻片即时放入消毒缸内。第26页，共64页，2023年，2月20日，星期一结果分析

生理盐水对照不应发生凝集，为均匀浑浊的乳状液。在红细胞悬液中，如红细胞凝集成片状，边缘皱褶如花边状或边缘松散为阳性。如与对照相同，为阴性。第27页，共64页，2023年，2月20日，星期一

临床意义

直接Coombs试验用于检测患者红细胞上不完全抗体，Coombs试验阳性可见于自身免疫性溶血性贫血、冷凝集素综合征、药物诱发的免疫性溶血性贫血、新生儿同种免疫性溶血病、某些高球蛋白血症患者，如系统性红斑狼疮、类风湿、恶性肿瘤等。

思考题

直接Coombs试验的原理及临床意义？第28页，共64页，2023年，2月20日，星期一二、间接Coombs试验（微柱凝胶法

）

实验目的1.掌握间接Coombs试验的原理和操作方法。2.熟悉Coombs试验的临床意义。第29页，共64页，2023年，2月20日，星期一患者血清靶红细胞致敏红细胞Coombs试剂检测血清中的抗红细胞抗体实验原理第30页，共64页，2023年，2月20日，星期一实验材料1.微柱凝胶卡内含抗球蛋白试剂；2.筛选红细胞一般由2~3人份O型红细胞组成一套试剂3.待测患者血清；4.生理盐水、小试管、吸管、试管架、离心机、温箱等。第31页，共64页，2023年，2月20日，星期一操作步骤撕开微柱凝胶卡密封纸，标记加1%筛选红细胞50μl及受检者血清25μl37℃孵育15min离心机离心10min，1000r/min

观察结果，如红细胞悬浮在反应管顶部或凝胶中，则为阳性结果；反之，如红细胞沉于凝胶底部（管底尖部），则为阴性结果。第32页，共64页，2023年，2月20日，星期一

注意事项1.反应卡封口有损坏，管中干涸或有气泡时，不可使用。使用前必须清楚标记试剂卡,一定要空离心一次后备用。2.不要将试剂卡长期保存4℃，在此温度下，试剂卡中液体蒸发凝集于封口铝箔下，胶易干涸，应将试剂卡保存在18~22℃。3.细胞浓度为0.8%~1%，浓度过高或过低，均可减弱凝集强度。4.纤维蛋白可吸附部分红细胞，导致假阳性结果。5.细菌污染、不适宜储存或过期都能使试剂失效。6.须设阴、阳性对照。7.微柱凝胶管中出现溶血现象，特别提示为红细胞抗原抗体阳性反应，也不排除其它原因所致溶血，对此标本一定要认真分析。第33页，共64页，2023年，2月20日，星期一结果分析

-100%的红细胞沉在微管的底部+/-100%的红细胞沉在微管的下端1/3之内1+80%的红细胞沉在微管的下端2/3之内2+80%的红细胞沉在微管的上端2/3之内3+80%的红细胞沉在微管的上端1/3之内4+凝集的细胞全部处于微管的顶部d.p.双群Hemo.溶血反应格局及判断标准第34页，共64页，2023年，2月20日，星期一

临床意义

间接Coombs试验用于检测患者游离血清中的不完全抗体。此实验多用于检测母体Rh（D）抗体，以便及早发现和避免新生儿溶血症的发生，亦可对红细胞不相容的输血所产生的血型抗体进行检测。第35页，共64页，2023年，2月20日，星期一小结和讨论1.检测抗红细胞不完全抗体的常用方法为抗球蛋白试验，又称为Coombs试验，直接Coombs试验用于检测患者红细胞上不完全抗体；间接Coombs试验用于检测患者游离血清中的不完全抗体。2.Coombs试验阳性可见于自身免疫性溶血性贫血、冷凝集素综合征、药物诱发的免疫性溶血性贫血、新生儿同种免疫性溶血病、某些高球蛋白血症患者，如系统性红斑狼疮、类风湿、恶性肿瘤等。第36页，共64页，2023年，2月20日，星期一

思考题

1.新生儿溶血症发生的机制是什么？

2.微柱凝胶免疫试验可能出现的结果有哪些，试分析原因？第37页，共64页，2023年，2月20日，星期一实验三循环免疫复合物的检测第38页，共64页，2023年，2月20日，星期一

实验目的1.掌握PEG比浊法检测循环免疫复合物的原理和方法。2.熟悉循环免疫复合物检测的临床意义。第39页，共64页，2023年，2月20日，星期一

实验原理

本试验是检测抗原非特异性循环免疫复合物的一种方法。PEG是环氧乙烷和水的多聚物，为一种不带电荷的直链大分子多糖。终浓度为3%～4%的PEG能相对选择性地沉淀CIC。用分光光度计测定浊度，反应沉淀物含量。第40页，共64页，2023年，2月20日，星期一

实验材料1.pH8.40.1mol/L硼酸盐缓冲液（BB）硼砂4.29g、硼酸3.40g，蒸馏水加至1000ml，溶解后用G3或G4号玻璃滤器过滤；2.PEG-NaF稀释液PEG600040.0g、NaF10.0g、BB加至1000ml，溶解后用G3或G4号玻璃滤器过滤；3.待检血清、微量加样器、试管、吸管及橡皮滴头等；4.分光光度计。第41页，共64页，2023年，2月20日，星期一加入物测试管对照管BB（ml）—2.0PEG-NaF稀释液（ml）2.0—待检血清（ml）0.20.237℃水浴60min分光光度计测A495nm值

操作步骤第42页，共64页，2023年，2月20日，星期一

注意事项1.4%PEG能沉淀较小的CIC，2%PEG只能沉淀较大的CIC，但浓度大于5%，PEG选择性沉淀CIC的特性即行消失，导致假阳性的出现。2.应注意实验温度变化对结果的影响，离心速度与时间也应严格掌握。3.低密度脂蛋白可引起浊度增加，故应空腹采血。4.高γ球蛋白血症以及血清标本反复冻融，均易造成假阳性。第43页，共64页，2023年，2月20日，星期一

结果分析待检血清浊度值=（测定管吸光度-对照管吸光度）×100，以大于正常人浊度值均值加2个标准差为CIC阳性。参考值：正常人血清CIC的A值为4.3±2.0，以≥8.3为免疫复合物阳性。第44页，共64页，2023年，2月20日，星期一

临床意义

循环免疫复合物（Circulationimmunecomplex，CIC）又称可溶性免疫复合物，分子量为50万～100万，沉降系数8.8～19S，它不易被吞噬细胞吞噬，又不能经肾小球排出，可较长时间在血液中循环，一旦大量循环免疫复合物沉积于组织中，则引起组织损伤及相关的免疫复合物病。CIC阳性常见于：1.部分自身免疫性疾病，如SLE，类风湿关节炎等；2.膜增殖性肾炎，链球菌感染后肾炎；3.传染病，如慢性乙型肝炎，疟疾，麻风等；4.恶性肿瘤。第45页，共64页，2023年，2月20日，星期一小结和讨论1.循环免疫复合物的检测有助于辅助诊断某些免疫复合物疾病，如血清病、SLE、慢性活动性肝炎时，CIC往往较高；此外，对CIC的动态检测有助于监视某些疾病的发展，协助判断疗效和预后；有助于探讨研究III型变态反应疾病的发病机制。2.此法快速简便，但特异性较差，仅适于筛选。CIC检测方法较多，原理各不相同，结果也不尽一样，因此最好采用多种方法同时进行，以提高阳性检出率。由于在病理状态下往往是单一种类抗原抗体复合物增高，这种增高只有达到影响总CIC水平才能被检出，所以有时检测抗原特异性CIC更为重要。第46页，共64页，2023年，2月20日，星期一思考题

循环免疫复合物检测的临床意义？第47页，共64页，2023年，2月20日，星期一病案讨论超敏反应性疾病第48页，共64页，2023年，2月20日，星期一实验目的

通过病案讨论、提出问题、应用免疫学技术检测有关免疫学指标，将免疫学技术应用于临床实践，对临床疾病做出诊断或医疗建议，进而对有关问题产生深入研究的学习动机。第49页，共64页，2023年，2月20日，星期一病案讨论一

患者王X，女28岁。因上呼吸道感染前来我院就诊。按医嘱作青霉素皮试阴性，给静滴青霉素800万U加5%GNS250ml。患者上午9点左右开始输液，约1点40分左右输液毕，无任何不适反应，下午3点左右患者感觉全身不适，似有好多虫子、蚂蚁在身上爬，全身紧困，随即出现心慌等不适前来复诊。一般尚可，痛苦面容，测BP100/70mmHg、P128次/分、心电监护提示频繁室早、R30次/分、明显缺氧症。遵医嘱给肌注肾上腺素1ml，5%GNS250ml，地塞米松10mg静滴；第二组10%GNS250ml，利多卡因100mg，给氧等处理后症状仍无明显改善转入入院治疗，入院后给抗过敏、抗心律失常治疗，一周后病人自觉症状消失，痊愈出院。

问题：1.该患者有可能属于哪型超敏反应？2.如何进行免疫学诊断？第50页，共64页，2023年，2月20日，星期一病案讨论二

第一胎足月儿，顺产无窒息，体重3200克，生后母乳喂养。第2天出现黄疸，第3天加重，测总胆红素18mg/dl，患儿精神较差，有贫血貌。体查：除黄疸外，无其他阳性体征。母亲为Rh阴性血型，胎儿为Rh阳性血型。问题：1.如何进行诊断和鉴别诊断？

2.还须做哪些实验室检查？

第51页，共64页，2023年，2月20日，星期一病案讨论三

患者何X，女，19岁，自3年前有间断关节疼痛，曾服用解热止痛的西药无明显好转，半年前出现面部红斑，发热，关节疼痛加重，诊断为“系统性红斑狼疮”，应用强的松及环磷酰胺等药物治疗，半年来面部红斑时轻时重，就诊时口服强的松每日15mg，面部蝶形红斑呈暗红色，双手红斑色鲜，自觉发热，五心烦热，体温正常，口干咽燥，失眠盗汗，口腔溃疡，脱发，疲乏，多关节疼痛，下肢皮下见数个紫斑，刷牙时偶有牙龈出血，腰部有酸痛感，饮食及二便正常，月经量少，色淡，舌淡红，苔薄黄，脉弦细，心肺无明显阳性体征。初步判断为III型超敏反应。化验血红蛋白103g/L，血白细胞5.0×109/L，血小板60×109/L，尿蛋白+++，24小时尿蛋白定量3.0g，尿中红细胞+，血沉34mm/h，肝肾功能正常，抗核抗体阳性，滴度为1:160，抗Sm抗体阳性，血免疫球蛋白系在正常范围，补体C3稍低于正常。问题：试分析还须做哪些实验室检查以进一步明确诊断？第52页，共64页，2023年，2月20日，星期一病案讨论四

女性，59岁，间断咳嗽、咳痰5年，加重伴咯血2个月。患者5年前受凉后低热、咳嗽、咳白色粘痰，给予抗生素及祛痰治疗，1个月后症状不见好转，体重逐渐下降，后拍胸片诊为“浸润型肺结核”，肌注链霉素1个月，口服利福平、雷米封3个月，症状逐渐减轻，遂自行停药，此后一直咳嗽，少量白痰，未再复查胸片。2个月前劳累后咳嗽加重，少量咯血伴低热、盗汗、胸闷、乏力又来诊。体查：两上肺呼吸音稍减低，并闻及少量湿罗音，心叩不大，心率94次/分，律齐，无杂音。结核菌素皮试阳性。问题：1、该患者属于哪一型超敏反应？2、还须做哪些实验室检查？第53页，共64页，2023年，2月20日，星期一病案讨论提示病案讨论一：1.该患者属于I型超敏反应。2.免疫学诊断分为体内检测（如皮肤试验）和体外IgE测定，详见实验一和临床见习。第54页，共64页，2023年，2月20日，星期一病案讨论二：1.诊断和鉴别诊断（1）生理性黄疸：生后2~3d出现，4~5d达到高峰，总胆红素值12.9mg/dl，7~10d消退。本例特点：总胆红素18mg/dl，超过峰值。（2）感染性黄疸：先天感染：查血“TORCH”

后天感染：有没有感染病灶本例无症状、无感染病灶、母亲无感染史，可排除感染性黄疸。因胎儿总胆红素18mg/dl，