细菌16SrDNA测序鉴定

本文格式为Word版，下载可任意编辑——细菌16SrDNA测序鉴定细菌16SrDNA测序鉴定一、细菌总DNA提取

二、16SrDNA的扩增

1、以单菌落或菌悬液为模板的16SrDNA扩增体系

25ul体系

Buffer(含有Mg2+)：2.5uldNTP：2.5ul：，

3-primer：0.5ul5，-primer：0.5ul

模板：1个单菌落（或1ul在LB培养液中37℃，12h的菌悬液）吐温20：2ulTaq酶：0.3

水：16.7（或15.7ul）

细菌16S

rDNA的通用引物为Pf-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和

Rf-TACCTTGTTACCACTT

许敬亮博士论文66页：扩增采用通用的引物，其正向序列为：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向互补序列为：5'-TTCAGCATTGTTCCAT-3'。

黄婷婷博士论文70页：5’端：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'（Escherichiacolibases8to27），

3’端：5'-TACCTTGTTACGACTT-3'（Escherichiacolibases1507to1492）。2、以总DNA为模板的16SrDNA扩增体系25ul体系

Buffer(含有Mg2+)：2.5ul(购买)dNTP：2.5ul：

3，-primer：0.5ul5，-primer：0.5ul模板：1ul

Taq酶：0.3（或0.2ul）双蒸水：17.7（或17.8ul）

3、PCR反应条件

94℃，5min；95℃，变性30s；50℃～52℃（可根据扩增状况进行适当调理），退火30s；72℃，延伸1min；30个循环；72℃，延伸15min；10℃(or4℃)，保温10min(ornh)。

4、检测扩增效果

取1～3ul扩增产物,适量loadbuffer，以DL2000为Marker，上0.75%琼脂糖凝胶跑电泳（电压挑低些80～100，胶长些，利于各扩增产物分开及回收切胶）注：扩增条件摸索时每个模板只扩1管即可

三、16SrDNA的回收

扩增出的每一管16SrDNA经0.75%琼脂糖凝胶电泳检测后，将效果好的各管16SrDNA合并使达到60～100ul样量，100ul16SrDNA+10ul溴酚蓝跑电泳回收胶(电泳液需换成新鲜的,DL2000为Marker)，EB染色后在紫外灯下切下16SrDNA条带放入1.5ml离心管中(离心管事先称重)，按DNA凝胶回收试剂盒操作说明回收16SrDNA，取回收16SrDNA2ul(Dl2000为Marker)跑电泳观测浓度(亮度)与纯度(条带数与位置)。

注：回收后的16SrDNA可直接送公司测序

四、16SrDNA与T载体酶连

连接体系

T载体连接液(购买)(含T4DNA连接酶)：5ul16SrDNA：4ulH2O：0.7ulT载体(购买)：0.3ul

上述溶液参与PCR管，在PCR仪中于16℃(or15℃)连接4～12小时

五、16SrDNA转化感受态细胞

1.从-70℃冰箱中取出一管E.ColiDH5α感受态细胞(200ul),于冰盒或冰浴上溶化,马上转至冰浴,放置10min。

2.用一冷的无菌吸头把将要转化的DNA片段(10ul)参与到装有200ul感受态细胞的管中,体积不应超过感受态细胞的5%,轻轻旋转几次混匀内容物,冰浴30min(轻轻混匀,使充分接触,可提高转化效率)。3.将管放入42℃水浴中,放置90s,不要摇动。4.快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却1～2min。

5.每管加800ulLB培养基,用水浴将培养基加温至37℃,然后将管转移至设置为37℃的摇床上,温浴45min,转速应小于225r/min.(常用100rpm)。

6.将适当体积(200ul)已转化的感受态细胞转移到相应抗生素的LB培养基平板上(Amp终浓度为100mg/L,X-gal终浓度为100mg/L)。

7.涂2-3个平板,剩余的已转化感受态细胞放4中保存,不成功可其次天再涂平板。

8.挑取可能含有靶基因DNA插入片段的白色菌落进行培养扩增,提取质粒DNA,利用质粒多克隆位点内的插入外源DNA片段侧翼的酶切位点用相应的限制性内切酶进行酶切鉴定，也可以直接用菌落PCR进行鉴定。9.以空载体PUCK18或PUCK19质粒为对照，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定克隆DNA片段的大小。

10.取1ml在LB中培养12h的转化细胞送公司测16SrDNA序列。

六、试剂配制

1、50×TAE(L)242gTris57.1ml冰醋酸

100ml0.5mol/LEDTA-Na2(PH:8.0)

2、0.5mol/LEDTA-Na2(PH:8.0)

186.1gEDTA-Na2,加70ml重蒸水，加7ml，加10mol/LNaOH,加热搅拌溶解后,再用10mol/LNaOH溶液调PH至8.0,加重蒸水至100ml，高压灭菌备用。

3、引物稀释

配成25u