细胞治疗原理及应用

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细胞治疗原理及应用

基本定义：

CIK（cytokine-inducedkiller，中文名：[自体细胞免疫疗法]多种细胞因子诱导的杀伤细胞），是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子（如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-γ等）共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。由于该种细胞同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子,故又被称为NK细胞样T淋巴细胞,兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。因此,应用CIK细胞被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。CIK细胞中的效应细胞CD3+和CD56+细胞在正常人外周血中极其罕见，仅1%—5%。2特点

CIK细胞中的效应细胞CD3+CD56+细胞在正常人外周血中极其罕见，仅1%～5%，在体外经多因子培养28～30天，CD3+CD56+细胞迅速增多，较培养前升幅可达1000倍以上。试验证明，扩增出的CD3+CD56+细胞来源于CD3+CD56-T细胞，而非CD3-CD56+NK细胞。同时发现在CD3+CD56-的T细胞中，除CD4+CD8-T细胞外，其余三种T细胞亚群（CD4-CD8+、CD4-CD8-、CD4+CD8+）均可通过体外多因子培养而获得CD56分子的表达，而由于CD4+CD8+细胞和CD4-CD8-细胞在正常人外周血中含量极低而间接提醒此CD3+CD56+细胞绝大多数来源于外周血中CD4-CD8+T细胞。而由于CD4-CD8-T细胞在培养1个月后有近56%的T细胞同时表达CD56和CD3，说明其也是CIK细胞的重要来源。比较CD3+CD56+CIK细胞中表达CD8+和CD8-,的两群细胞其杀瘤活性没有显著性差异，提醒CIK细胞的细胞毒性与CD3CD56表达成相关趋势，而与CD8的表达未表现出相关性。

1.CIK细胞增殖速度快，抗肿瘤活性细胞可大量增殖，且细胞活性也大大加强。2.CIK细胞具有识别肿瘤的机制，对正常的细胞无毒性作用。

3.杀瘤谱广，可用于白血病、淋巴瘤、肺癌、胃癌、肠癌等多种肿瘤的治疗，对多重耐药肿瘤细胞同样敏感。

4.是典型的特性化生物治疗模式。将这类细胞回输后，还能使机体免疫能力提高，产生特异的抗病毒作用，从而对肿瘤治疗施以双重的作用。5.由于CIK细胞是活化的自体细胞，用起来十分安全。3杀伤原理

CIK细胞能够通过三种途径杀灭肿瘤细胞和病毒感染细胞：

①CIK细胞对肿瘤细胞和病毒感染细胞的直接杀伤：CIK细胞可以通过不同的机制识别肿瘤细胞，释放颗粒酶/穿孔素等毒性颗粒，导致肿瘤细胞裂解。②CIK细胞释放的大量炎性细胞因子具有抑瘤杀瘤活性：体外培养的CIK细胞可以分泌多种细胞因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-2等，不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用，还可通过调理机体免疫系统反应性间接杀伤肿瘤细胞。

③CIK细胞能够诱导肿瘤细胞的凋亡：CIK细胞在培养过程中表达FasL（Ⅱ型跨膜糖蛋白）通过与肿瘤细胞膜表达的Fas（Ⅰ型跨膜糖蛋白）结合，诱导肿瘤细胞凋亡。

CIK细胞发挥作用的三种途径4杀瘤特点编辑

应用LAK细胞是目前较为普及的肿瘤过继免疫治疗方案，广泛使用于黑色素瘤、肾细胞癌、非霍奇金淋巴瘤、肺癌和结肠癌。因LAK细胞扩增数量有限，杀瘤活性也较TIL等T淋巴细胞为低，故虽然杀瘤谱广，但效果局限。相比较而言，TIL细胞本身较LAK细胞具有更强大的抗瘤效力，但由于杀瘤谱窄，制备困难，

及在收集过程中可能导致的功能改变而限制了其临床应用价值。与上述两种效应细胞过继免疫治疗相比，CIK细胞具有独特的优势，列举如下。1.增殖速度快

CIK细胞在培养过程中参与IFN-γ、IL-1α、抗CD3、McAb、IL-2等多因子后，细胞增殖速度迅速加快，远超过LAK细胞。在培养第22天增殖曲线达顶峰，约增加100倍，其中CD3+CD56+细胞不仅绝对数量增加1000倍以上，且所占百分比也大幅上升，培养至28～30天时达平台期，细胞毒活性亦达峰值，而LAK细胞培养前后数量没有明显增加。2.杀瘤活性高

CIK细胞是以CD3+CD56+T细胞为主的异质细胞群，大量体内外试验证明CIK细胞较以NK细胞为主的LAK细胞具备更强大的杀瘤活性，而且其体内杀瘤细胞毒性的维持不必依靠大剂量外源性IL-2的持续给予。体外试验中，任欢和Lu等均发现在体外等数量的CIK细胞比LAK细胞对肿瘤细胞系的杀伤能力稍高或相近，但因CIK细胞在培养过程中CD3+CD56+效应细胞增长迅速，故CIK细胞的总杀伤单位（TLU）为LAK细胞的73倍甚至更高，其杀伤效率显著高于LAK细胞。肿瘤克隆抑制试验显示，CIK细胞的瘤细胞抑制Log指数为2.5～3.5，较LAK细胞的瘤细胞抑制指数高2个Log。体内试验发现，对于在严重联合免疫缺陷小鼠身上构建的人类B细胞淋巴瘤SU-DHL4模型，CIK细胞在清除荷瘤鼠体内肿瘤病灶，抑制转移，延长生存期等方面的作用均明显优于LAK细胞。3.杀瘤谱广

CIK细胞虽然以CD3+CD56+T细胞为主要效应细胞，但却没有T淋巴细胞杀伤时的MHC限制性，故对于多种肿瘤细胞系（包括NK敏感的K562和NK不敏感的Hela、HL60、人T细胞急淋白血病细胞系OCRF-CEM，人淋巴瘤细胞系OCI-LY8、LAM53，人结肠癌细胞系HT-29、CR75，人肾癌细胞系A704）和新鲜肿瘤组织均表现出强大的杀伤活性。

4.对多重耐药肿瘤细胞同样敏感

Wolf用阿霉素和长春新碱诱导出多重耐药细胞系K562/DOX和CCRF-CEM-VBL，发现CIK细胞对化疗药物敏感的亲本细胞和不敏感的转化细胞均具有强大的杀伤活性，两者比较无区别。

5.杀瘤活性不受CsA、FK506等免疫抑制剂的影响

Mehta观测到免疫抑制剂CsA和FK506虽然可以抑制抗CD3单抗介导的CIK细胞脱颗粒过程，却不影响靶细胞诱导的CIK细胞脱颗粒，并且CIK细胞对靶细胞的杀伤活性不会因此降低。

6.对正常骨髓造血前体细胞毒性很小

Seheffold通过CFU-GM形成试验检测CIK细胞对骨髓造血前体细胞的影响，发现CIK细胞对K562细胞的杀伤强度高达3级，但对GM-CFU仅有不足1级的抑制。Holye也证明CIK细胞对正常髓系克隆生成几乎没有影响，只是对红系的生成显示出轻度抑制，这可能与CIK细胞自身分泌较高水平的IFN-γ有关。7.能抗争肿瘤细胞引发的效应细胞Fas-FasL凋亡

已证明过继免疫治疗失败的一个重要原因是过继效应细胞被肿瘤细胞表面表达的某些蛋白（主要是FasL）诱导凋亡，而CIK细胞虽然在Fas被占据后会引起少量细胞凋亡，但对其杀瘤细胞毒性没有明显影响。Verneris的试验提醒CIK细胞内有抗凋亡基因表达，并检出多种保护基因，如cFLIP、Bcl-2、Bcl-X1、DAD1和survivin的转录水平上调。同时发现CIK细胞具备合成FasL的能力，CIK细胞培养上清中可以检测到具生物学活性的水溶性FasL，说明CIK细胞可以对抗体内FasL阳性肿瘤所引发的效应细胞活性下降甚至消失。5影响因素编辑

1.外源性细胞因子的补充

CIK细胞的体外扩增需要外源性细胞因子，如IL-2、IL-7、IL-12等的辅助，这些因子控制着人免疫系统内各种抗原特异性细胞的扩增及其生物学活性。外源性IL-2、IL-7、IL-12可以显著促进淋巴细胞的生长，特别存在有IL-2和IL-7条件下CIK细胞的增殖率为高，而外源性,IL-2、IL-7、IL-12对CIK细胞的细胞毒活性没有影响。外源性IL-2和IL-7的刺激会降低CIK细胞表面相应受体的表达量，而CD28分子在IL-7存在条件下较IL-2时表达更高。IL-12会降低CIK细胞表面ICAM-1的表达，IL-7则会提高CD56的表达。与IL-2相比，IL-7可明显增加CD4+细胞的比例。虽然外源性IL-2、IL-7和IL-12培养过程中均可出现

少量凋亡细胞，但有研究显示外源性IL-12的添加会增加CIK细胞中坏死细胞的比例。

抗CD3McAb不仅在CIK细胞培养过程中起着重要作用，在提高CIK细胞对白血病及淋巴瘤的杀伤敏感性上同样具有促进作用。Lefterov将抗CD3McAb与靶细胞预先共同孵育可增加CIK细胞对其的杀伤敏感性，而且这种加强作用可以被抗FcR的抗体（如抗CD36、抗CD32）所部分阻断，间接证明抗CD3McAb引发的杀伤活性增高与FcR介导的抗体结合有关。2.多种细胞因子基因的转染

由于CIK细胞扩增对外源性细胞因子有依靠，因此通过基因转移方法将相关基因转入CIK细胞，不仅可减少外源性细胞因子的使用量，还可提高CIK细胞自身的抗瘤活性。

IL-7：Fitke利用改进的腺病毒转基因系统将人IL-7基因转染CIK细胞，发现转染后细胞可以生成较高浓度IL-7，最多者可达1100pg/106cell/24h。合成的IL-7具有明显的生物学活性，可以促进转染CIK细胞的增殖，显著高于未转染细胞。外源IL-7基因的表达同时改变了CIK细胞对其他细胞因子的分泌，其中尤以TNF-α分泌显著升高，这一现象在未转染CIK体外添加IL-7时并未观测到。虽然转染后CIK细胞表面各种与细胞杀伤活性相关的表面抗原，如ICAM-1等与未转染CIK细胞相比无明显变化，但转染后CIK细胞在对多种肿瘤细胞系如肾癌、恶性黑色素瘤以及结肠癌的杀伤能力较未转染CIK细胞有明显加强。IL-2：Lu等发现CIK细胞培养过程中CD56分子的表达是IL-2依靠性的，但单独IL-2的存在却会降低培养后CIK细胞的表型变化幅度。尽管有试验指出CIK细胞的体内治疗并不需要IL-2体外持续供给，但Zoll等的研究结果说明，体外培养中IL-2对CIK细胞的增殖