生物化学与分子生物学试验步骤总结

本文格式为Word版，下载可任意编辑——生物化学与分子生物学试验步骤总结试验步骤：

一：RT-PCR检测

1、用冷的PBS冲细胞2次，参与1mLTrizol(12孔板每孔参与0.5ml)，静置3-4min。将裂

解液转入已标记好相应批次的灭酶EP管中，参与氯仿0.2ml（1/5Trizol体积），用手猛烈震摇15s，置室温5min可见分层。将离心机预冷至4°C，12000rpm，30min，可见分层。

2、防备吸上层水相约0.5ml，置于另一1.5ml灭酶EP管，此操作确保不要吸入中间层和有

机相，降低蛋白质等污染。各管分别参与0.5ml（等体积）异丙醇，摇匀，置于-80°C，过夜放置。4°C，12000rpm，30min，可见白色片状RNA沉淀。

3、倒弃上清液，参与1ml预冷的75TPC乙醇，用手指轻弹管壁使RNA飘起，充分清

洗RNA沉淀，4°C12000rpm，15min。洗涤2遍。

4、弃上清后，将管底余液尽量吸净。室温枯燥沉淀约20min，参与20μlDEPC水，充分溶

解离心。取1μl测OD值确定RNA浓度ng/μl，其余-80°C保存备用。5、依照罗氏逆转录试剂盒进行逆转录，体系为20μl。

反应体系

试剂RTReactionBuffer(5×)dNTPPrimer(Random)逆转录酶RNase抑制剂RNAH2O

6、用7900仪器进行RT-PCR，采用SYBRGreen法。

RT-PCR体系如下：试剂SYBRGreenmixddH2O上游引物下游引物cDNA体积（μl）53.60.20.21体积（μl）4220.50.51000/RNA浓度（ng/μl）11-RNANote:逆转录过程中，需建立无RNAse环境，避免RNA的降解。在冰排上进行相关操作。二：HUVEC细胞培养

（一）人脐静脉内皮细胞的分开

提前准备好溶于PBS溶液的I型胶原酶液并过滤除菌。

1、选取健康孕妇无病毒感染、无扭曲、打折的新生儿新鲜脐带（15-20cm），用0.9%的生

理盐水检查脐带的完整、并冲洗内壁血细胞等；

2、双向确认脐带无破损后，将脐带两头都用止血钳和注射器针头插入静脉夹紧，将I型胶

原酶液注入脐带内，把脐带静置于存有生理盐水的培养皿内15min，可轻柔按摩血管以增加细胞脱落，同时控制消化时间在20min以内。

3、消化完成后，将脐带内的消化液打出到一个清白的50ml离心管内，用盐水冲洗脐带内

剩余消化液至离心管20ml处，将离心管800g，8min，再取一根脐带进行一致步骤；

4、离心后，弃上清，用5ml培养基吹吸两管沉淀混匀后，将全部液体转移至T25细胞培养

皿内，标记细胞种类、日期、姓名，松口放入37°C，5%的CO2培养箱培养细胞，其次天细胞贴壁后，观测。Note:

0.9%生理盐水在取脐带细胞前两天配好高压灭菌；止血钳、剪刀等也用75%乙醇浸泡过夜，用蒸馏水洗涤3遍，晾干，高压灭菌备用；提前备好一定数量的注射器即可。（二）复苏

1、将冻存管从液氮中取出，马上投入37°C水浴锅中，微弱摇动，均匀受热。2、将上述细胞悬液转移至15ml离心管中，800g离心8min。

3、弃掉上清，参与1ml培养基把细胞悬浮起来，吸入装有4mlECM培养的T25培养皿中微弱晃动使皿中细胞分布均匀。标记好细胞种类和日期姓名等，松口瓶盖放入5%CO2培养箱培养细胞。

4、三天左右换一次培养基。（三）传代

1、培养皿中细胞覆盖率达到80%-90%后进行传代。

2、吸去原有培养基。参与适当的胰蛋白酶液（T25-200μL，T75-600μL），37°C培养箱消化1-2min。

3、细胞变圆后参与培养基终止消化（T25-5ml，T75-10ml），用移液枪吹打细胞至细胞都悬浮起来。

4、铺板：把细胞吸到培养皿中，吹打混匀。12孔板按每孔0.7ECM+0.3ml细胞重悬液，继续培养。标好细胞代数，置于CO2培养箱中培养。（四）冻存

将细胞消化后用培养基悬浮起来细胞，分装到灭菌的冻存管中，DMSO要缓慢参与，90%细胞悬液+10%DMSO，静置几分钟，在管上注明细胞种类，代数，冻存日期。4°C30min，-20°C30min，-80°C过夜，之后放到液氮罐中保存即可。一、细胞siRNA转染1、转染前一天，将HUVEC细胞接种到12孔板上，0.7ml含FBS和抗生素的ECM和0.3ml

细胞重悬液。

2、选择在24小时内使细胞会集达到70%-90%，将细胞培养基换液0.9ml。48μLOpti-MEM，

参与2μLRNAimax，48μLOpti-MEM参与2μLsiRNA，将上述混合液合并为100μL，室温放置5分钟，参与1个12孔板中。3、将转染后的细胞板放在37°C5%CO2培养箱中温育48小时候，进行其他检测步骤。将转

染后的同批次检测eNOSmRNA水平和蛋白水平。三：DAF-FM1、装载探针

①用20μLDMSO溶解DAF-FMDA原固体，DAF-FMDA储存液（-20℃）浓度为5mM，

再用无血清培养基稀释，DAF-FMDA工作液浓度为5μM；②除细胞培养液后，参与适当体积稀释好的DAF-FMDA

12孔板内单孔1ml的DAF-FMDA工作液。37°C孵育20min。③去除工作液后，用新鲜培养基37°C孵育20-30min。PBS洗涤三次细胞，充分去除

未进入细胞的DAF-FMDA。

2、检测：在荧光倒置显微镜下用不同倍数的镜头直接观测细胞，留片即可。

四：Westenblot检测

1、收集蛋白样品：使用蛋白裂解液70μL/孔，静置于冰上20min，煮沸15min，充分变性蛋

白。

2、电泳：冷却到室温，把蛋白样品直接上样到SDS胶加样孔内即可。寻常浓缩胶使

用低电压恒压80V，在溴酚蓝进入分开胶时，使用高电压恒压电泳120V。时间为90-120min，寻常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近便可以中止电泳。3、转膜：选用硝酸纤维素膜（NC膜），湿式转膜方法，层叠像三明治模式一样将膜与胶放

置在一起，将膜与胶中间的气泡赶走（重要！），膜白胶黑，设定转膜电流为200mA，转膜时间为90min。4、封闭：转膜完成后，注意膜的保湿，避免其枯燥，参与western封闭液，室温封闭60min。5、一抗孵育：依照比例1:1000稀释一抗。4°C缓慢摇动，过夜孵育，之后回收一抗，-20°C

保存。用1×TBST反复洗涤3次膜，每次10min。6、二抗：按比例1:3000稀释二抗，室温在摇床缓慢摇动孵育1.5小时。回收二抗，用1×TBS