灭菌及染菌的防治生

灭菌及染菌的防治生第1页，共66页，2023年，2月20日，星期一上节回顾培养基的基本组成与功能：

碳源、氮源、水、无机盐及微量元素、生长因素前体、诱导物（刺激物）、抑制剂。培养基的种类：

按来源、状态、用途等分类。培养基的制备：

母液的配制与保存培养基的配制第2页，共66页，2023年，2月20日，星期一目录灭菌概述培养基灭菌发酵罐的灭菌空气的除菌染菌的防治第3页，共66页，2023年，2月20日，星期一4第一节灭菌概述消毒---灭菌消毒是指用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。

灭菌是用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。消毒不一定能达到灭菌要求，灭菌则可达到消毒的目的。

第4页，共66页，2023年，2月20日，星期一高温灭菌辐射作用过滤作用高渗作用超声波一、物理灭菌因素－高温火焰灼烧法烘箱热空气灭菌法干热灭菌法煮沸消毒法巴氏消毒法间歇灭菌法高压蒸汽灭菌法湿热灭菌（消毒）法高温灭菌（消毒）法低温维持法（LTH）高温瞬时法（HTST）超高温瞬时法（UTP）湿热的灭菌条件：多数细菌和真菌的营养细胞：60℃左右处理5-10min；酵母菌和真菌的孢子：80℃才能被杀死；细菌的芽孢：121℃处理15min。5第5页，共66页，2023年，2月20日，星期一辐射灭菌(RadiationSterilization)是利用电磁辐射产生的电磁波杀死大多数物质表面或内部微生物的一种有效方法。用于灭菌的电磁波有微波，紫外线(UV)、X-射线和γ-射线等6二、辐射作用6第6页，共66页，2023年，2月20日，星期一紫外线

原理：波长200-300nm的紫外线具有杀菌作用。其中260~266nm波长UV与DNA吸收光谱一致。其主要作用于DNA，使一条DNA链上相邻的两个胸腺嘧啶共价结合形成二聚体，干扰DNA复制与转录，导致细菌变异和死亡，并可杀灭病毒。特点：穿透力较弱应用：物体表面及空气消毒，如无菌室、接种箱

7第7页，共66页，2023年，2月20日，星期一空气和不耐热的液体培养基的灭菌采用比细菌小的筛子或滤膜作各种过滤器，当空气或液体流经筛子或滤膜时，微生物不能通过滤孔而被阻留在一侧，从而达到灭菌的目的。三、过滤除菌8第8页，共66页，2023年，2月20日，星期一是一种机械的作用因素，每秒超过2万次振动的声波即为超声波。常用的超声波发生器能产生20-100千赫的声波。可使细菌细胞壁裂解而死亡。四、超声波杀菌法9第9页，共66页，2023年，2月20日，星期一原理：许多化学药剂渗透到微生物细胞内进行氧化、还原、水解等化学作用，引起细胞内蛋白质变性、酶类失活或细胞溶解而杀灭微生物。使用范围：器皿、双手和厂房、实验室、无菌室等环境灭菌，空间的消毒和溶氧电极等器具的消毒。不适合用于培养基的灭菌。常用的灭菌剂：如甲醛、苯酚、高锰酸钾、洁尔灭、氯化汞等。五、化学物质灭菌10第10页，共66页，2023年，2月20日，星期一常用的灭菌剂有效浓度化学物质名称有效浓度新洁尔灭(苯扎溴铵)0.25%甲醛37%杜灭芬0.25%戊二醛2%高锰酸钾0.1%-0.25%苯酚0.1%-0.15%漂白粉5%过氧乙酸0.02%-0.2%酒精75%焦碳酸二乙酯0.01%-0.1%煤酚皂（来苏尔）1%—5%

*11第11页，共66页，2023年，2月20日，星期一六、臭氧灭菌

利用臭氧的氧化作用杀灭微生物细胞。臭氧在常温、常压下分子结构不稳定，很快自行分解成氧气(O2)和单个氧原子(O)，后者具有很强的活性，对细菌有极强的氧化作用。

不存在任何有毒残留物，故称无污染消毒剂。臭氧不但对各种细菌(包括大肠杆菌、铜绿假单胞菌及杂菌等)有极强的杀灭能力，而且对杀死霉菌也很有效。臭氧灭菌是新近发展起来的一种消毒方式，具有使用安全、安装灵活、杀菌作用明显的特点，主要用于洁净室及净化设备的消毒。12第12页，共66页，2023年，2月20日，星期一渗透压灭菌七、渗透压灭菌渗透压灭菌利用高渗透压溶液进行灭菌的方法。在高浓度的食盐或糖溶液中细胞因脱水而发生质壁分离，不能进行正常的新陈代谢，结果导致微生物的死亡。第13页，共66页，2023年，2月20日，星期一14

一、培养基灭菌

指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及其孢子，或从中将其除去。

工业规模的液体培养基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更为常用。

第二节培养基灭菌第14页，共66页，2023年，2月20日，星期一15工业上具体措施包括：

①使用的培养基和设备须经灭菌；

②好氧培养中使用的空气应经除菌处理；

③设备应严密，发酵罐维持正压环境；

④培养过程中加入的物料应经过灭菌；

⑤使用无污染的纯粹种子。二、培养基灭菌的措施15第15页，共66页，2023年，2月20日，星期一16三、培养基灭菌的要求（1）达到要求的无菌程度（10-3）；（2）尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中，培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的：培养基中不同营养成分间的相互作用；对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。16第16页，共66页，2023年，2月20日，星期一17湿热灭菌原理蒸汽具有很强的穿透能力，而且在冷凝时会放出大量的冷凝热，很容易使蛋白质凝固而杀死各种微生物。

灭菌条件121℃，30min。

灭菌缺点同时会破坏培养基中的营养成分，甚至产生不利于菌体生长的物质。四、培养基的湿热灭菌

湿热灭菌的效果，取决于致死温度和致死时间。灭菌优点蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒；蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底；蒸汽有很大的潜热；操作方便，易管理。17第17页，共66页，2023年，2月20日，星期一18致死时间：是在致死温度下或以上杀灭微生物所需时间。湿热灭菌中的相关定义：致死温度：是杀灭微生物的极限温度。在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。第18页，共66页，2023年，2月20日，星期一19在实际生产中，由于不能完全了解杂菌的数量和种类。因此要以相对热阻大的芽孢杆菌作为灭菌的依据。热阻（对热抵抗力）：微生物在某一特定条件（一定的温度、加热方式）的死亡时间。相对热阻：指在相同条件下两种微生物热阻的比值。微生物相对热阻营养细胞和酵母1.0细菌芽孢3×106霉菌孢子2~10病毒和噬菌体1~5第19页，共66页，2023年，2月20日，星期一高温对培养基的不利影响：▲会产生混浊或形成不溶性沉淀▲营养成分被破坏（PO4-3存在，葡萄糖生成酮糖，菌不利用）；▲色泽加深（褐变如产生氨基糖等）；▲改变培养基的pH值（通常下降0.2）；▲形成有害物质，抑制微生物生长；消除有害影响的措施▲采用特殊的加热灭菌法▲过滤除菌法▲加入螯合剂五、高温对培养基的影响及其防止措施第20页，共66页，2023年，2月20日，星期一21微生物的种类微生物细胞中水分对灭菌的影响细胞含水越多，蛋白质变性的温度越底微生物细胞菌龄对灭菌的影响老细胞水分含量低、低龄细胞水分含量高培养基中微生物数量对灭菌的影响六、影响灭菌的因素

第21页，共66页，2023年，2月20日，星期一培养基成分对灭菌的影响：油脂、蛋白质增加微生物的耐热性，高浓度的盐类，色素等可削弱其耐热性。培养基的成份油脂、糖类及蛋白质等组成的高浓度有机物会包于细胞的周围形式一层薄膜、影响热的传导，所以可采用较高的灭菌温度以及稍长的灭菌时间；低浓度有机物灭菌温度可适当降低。低浓度(1.0％～2.0％)的氯化钠溶液对微生物有保护作用，但随着浓度的增加，保护作用随之降低，易引起细胞蛋白质变性，当浓度达到8％～10％以上时，微生物的耐热性显著减弱，有利于灭菌。第22页，共66页，2023年，2月20日，星期一培养基中的颗粒：固体颗粒的存在影响热穿透。培养基中不宜含有过多颗粒物质，因为颗粒内部容易潜藏微生物，而颗粒物质本身就是一道隔热层，使微生物不易受热被杀灭。颗粒愈大，灭菌难度愈大。蒸汽中空气的存在降低蒸汽分压和灭菌温度。但是如果罐内空气排除不完全，压力表所显示的压力不单是罐内蒸汽压力，还包括了空气分压。此时罐内的实际温度就低于压力表显示压力所对应的温度，以致造成灭菌温度不够而灭菌不彻底。第23页，共66页，2023年，2月20日，星期一培养基中氢离子浓度对灭菌的影响：培养基中氢离子浓度直接影响灭菌的效果。培养基的酸碱度越大，所需杀灭微生物的温度越低。pH6~8时，微生物最耐热。pH小于6时，氢离子易渗入细胞内，改变细胞的生理反应促使其死亡。所以培养pH值愈低，所需灭菌时间愈短。泡沫的多少：培养基内的泡沫对灭菌不利。因为泡沫中的空气形成隔热层，影响热量传递，使热量难以渗透进去，不易杀死泡沫中的微生物，所以对容易产生泡沫的培养基，在灭菌前应适当加入少量消泡剂。第24页，共66页，2023年，2月20日，星期一分批灭菌连续灭菌七、培养基灭菌的方法25第25页，共66页，2023年，2月20日，星期一

分批灭菌是将配制好的培养基输入发酵罐内，用直接蒸汽加热，达到灭菌要求的温度和压力后维持一定时间，再冷却至发酵要求的温度，这一工艺过程称为分批灭菌或实罐灭菌。

1.分批灭菌（batchsterilization）26第26页，共66页，2023年，2月20日，星期一27过程包括：升温、保温和冷却三阶段。各阶段对灭菌的贡献：

20%、75%、5%。24016012080时间（min)050100150温度升温冷却保温培养基分批灭菌过程中的温度变化情况分批灭菌的设计在发酵罐中，进行实罐灭菌，是典型的分批灭菌。第27页，共66页，2023年，2月20日，星期一

全过程包括升温、保温、降温三个过程。灭菌时间：t总=t1+t2+t3

灭菌作用：Δ总=Δ加热+Δ维持+Δ降温如果知道t1和t3，合理设计维持时间t2、亦能减少灭菌过程中培养基营养成分的破坏。28第28页，共66页，2023年，2月20日，星期一1.不需专门的灭菌设备，设备投资少2.灭菌后再次染菌的危险性较小3.发酵罐内有搅拌，加热时上下翻腾灭菌较均匀4.适于起泡性强、黏度大和含固形物较多的培养基灭菌优点29第29页，共66页，2023年，2月20日，星期一升温时间保温时间冷却时间缺点加热和冷却时间长，发酵罐的周转率低，不能适应大规模连续生产的要求，适于小型发酵厂生产。对培养基的营养成份破坏大不能采用高温快速灭菌工艺30第30页，共66页，2023年，2月20日，星期一又称连消，即培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后送入已灭菌的发酵罐内的工艺过程。2.连续灭菌（continuoussterilization）31第31页，共66页，2023年，2月20日，星期一发酵罐蒸汽蒸汽冷却水无菌培养基配料罐泵加热塔维持罐冷却管

连续灭菌的基本设备一般包括（1）配料预热罐，将配制好的料液预热到60-70℃

，以避免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声；（2）连消塔，连消塔的作用主要是使高温蒸汽与料液迅速接触混和，并使料液的温度很快升高到灭菌温度（126-132℃）；（3）维持罐，连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的，维持罐的作用是使料液在灭菌温度下保持5-7min，以达到灭菌的目的；（4）冷却管，从维持罐出来的料液要经冷却排管进行冷却，生产上一般采用冷水喷淋冷却，冷却到40-50℃后，输送到预先已灭菌的罐内。由连消塔、维持罐和冷却器组成的连消系统32第32页，共66页，2023年，2月20日，星期一可采用高温快速灭菌工艺，营养成分破坏的少；发酵罐非生产占用时间缩短，容积利用率提高；热能利用合理，适合实行自动化控制；不适合用于粘度大或固形物含量高的培养基的灭菌；增加一套连续灭菌设备，增多了操作环节，增加了染菌的几率。特点33第33页，共66页，2023年，2月20日，星期一34分批灭菌与连续灭菌优点缺点连续灭菌1.高温短时灭菌，培养基营养成分损失少。2.发酵罐占用时间缩短，利用率高。

1.设备复杂，操作麻烦,

染菌机会多。2.不适合含大量固体物料的灭菌。分批灭菌1.设备要求低，不需另外加热、冷却装置。2.操作要求低，适合小批量生产规模3.适合含大量固体物料灭菌1.培养基的营养物质损失大，灭菌后培养基质量下降2.发酵罐的利用率较低3.不适合大规模生产灭菌第34页，共66页，2023年，2月20日，星期一分批灭菌连续灭菌实验室采用湿热灭菌法：121℃，20-30min大规模生产35第三节发酵罐的灭菌

35第35页，共66页，2023年，2月20日，星期一36第36页，共66页，2023年，2月20日，星期一37

培养基的灭菌如果是采用连续灭菌法，则发酵罐应在加入灭菌的培养基前先行单独灭菌。通常是用蒸汽加热发酵罐的夹套或蛇管并从空气分布管中通入蒸汽，充满整个容器后，再从排气管中缓缓排出。容器内的蒸汽压力保持1公斤，20分钟。在保温结束后，关键是随即通入无菌空气，使容器保持正压，防止形成真空而吸入带菌的空气。第37页，共66页，2023年，2月20日，星期一38第四节空气除菌一、无菌空气的概述在发酵工业中，绝大多数是利用好气性微生物进行纯种培养，空气则是微生物生长和代谢必不可少的条件。无菌空气的制备就成为发酵工程中的一个重要环节。发酵工业应用的“无菌空气”是指通过除菌处理使空气中含菌量降低在一个极低的百分数，从而能控制发酵污染至极小机会。此种空气称为“无菌空气”。38第38页，共66页，2023年，2月20日，星期一空气中微生物的分布特点⑴不同地区：城市多，农村少；主风向多，上游少。⑵不同高度：位置越高，数量越少，所以采用高空采风一般每升高10米，微生物数量下降一个数量级。⑶不同季节：冬季少，夏季多，夏季约4000-6000个/立方米，为冬季的2倍。39第39页，共66页，2023年，2月20日，星期一辐射灭菌加热灭菌化学药品杀菌静电除菌介质过滤将有机体蛋白质变性而破坏其活力，从而杀灭空气中的微生物空气除菌：除去或者杀死空气中的微生物。二、空气除菌方法40第40页，共66页，2023年，2月20日，星期一41二、空气除菌方法（一）辐射灭菌（二）化学杀菌

用新洁尔灭，苯酚等喷洒或用甲醛熏蒸，硫磺熏蒸，进行空气灭菌，灭菌时间长，灭菌不彻底，空气湿度大，也只限于静止空间的灭菌。

利用高能射线来进行灭菌，如紫外线，γ射线等，其杀菌时间长，只能用于静止空间的灭菌，如无菌室的灭菌，对于流动的空气效果差。第41页，共66页，2023年，2月20日，星期一42（三）加热灭菌加热灭菌即将空气加热到一定温度后，保温一定时间，将微生物杀死的方法。

优点：加热灭菌效果迅速，如细菌芽胞。

缺点：迅速加热和冷却费用高，周期长时，稳态难以维持。第42页，共66页，2023年，2月20日，星期一利用高压20-50KV电压进行除菌，微生物的细胞与孢子大都带有电荷，即使不带电荷，在高压电场中也会被电离，带电的细胞或孢子在高压电场中被吸附，达到除菌的目的。

该方法除菌能耗虽不高，每处理1000立方米空气仅耗电0.2-0.8KW，但所需的电压高，操作不安全，且除菌效率不高，在85%-99%之间，制备的无菌空气不符合要求。（四）静电除菌43第43页，共66页，2023年，2月20日，星期一44（五）介质过滤除菌

介质过滤是目前发酵工业上常使用的空气除菌方法。它采用定期灭菌的干燥介质来阻截流过的空气中所含的微生物，从而制得无菌空气。

常用的过滤介质有棉花；活性炭或玻璃纤维、有机合成纤维、有机和无机烧结材料等。

第44页，共66页，2023年，2月20日，星期一

特点：

利用过滤介质阻截进入的空气的尘埃和微生物，除菌效率高，处理能力大，可以达到发酵生产所需用的无菌要求，且投资少，能耗低，工厂普遍采用。第45页，共66页，2023年，2月20日，星期一空气压缩机过滤除菌工艺过程空气前过滤空压机冷却分离加热过滤46第46页，共66页，2023年，2月20日，星期一两级冷却分离加热除菌流程471粗过空滤器、2空压机、3贮罐、4、6冷却器、5旋风分离器、7丝网分离器、8加热器、9过滤器第47页，共66页，2023年，2月20日，星期一48第五节染菌的防治发酵过程中除了生产菌以外，还有其它菌生长繁殖。设备渗漏、空气带菌、种子带菌、灭菌不彻底及管理不善等是造成染菌的普遍原因。一、染菌概述第48页，共66页，2023年，2月20日，星期一49竞争营养物质，导致产量下降；产生一些代谢产物，改变发酵液的理化特性，使后提取困难，收率下降，质量降低；杂菌可能会产生生长菌的抑制物或分解产物；感染噬菌体时，会造成菌体消失，发酵彻底失败；杂菌杂菌大量繁殖后，会改变反应液的pH值，使反应异常。1.污染杂菌的危害：第49页，共66页，2023年，2月20日，星期一502.污染不同种类和性质的微生物的影响（1）污染噬菌体：噬菌体的感染力很强，传播蔓延迅速，也较难防治，故危害极大。污染噬菌体后，可使发酵产量大幅度下降，严重造成断种，被迫停产。第50页，共66页，2023年，2月20日，星期一51（2）污染其它杂菌有些杂菌会使生产菌自溶产生大量泡沫，即使添加消泡剂也无法控制逃液，影响发酵过程的通气搅拌。有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使pH下降，使不耐酸的产品破坏。特别是染芽孢杆菌，由于芽孢耐热，不易杀死，往往一次染菌后会反复染菌。第51页，共66页，2023年，2月20日，星期一523.不同时间染菌对发酵的影响

污染时间是指用无菌检测方法确准的污染时间，不是杂菌窜入培养液的时间。杂菌进入培养液后，需有足够的生长、繁殖的时间才能显现出来，显现的时间又与污染菌量有关。污染的菌量多，显现染菌所需的时间就短，污染菌量少，显现染菌的时间就长。第52页，共66页，2023年，2月20日，星期一53（1）种子培养期染菌由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势，而且培养液中几乎没有抗生素（产物）或只有很少抗生素（产物）。因而它防御杂菌能力低，容易污染杂菌。

如在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。

第53页，共66页，2023年，2月20日，星期一54（2）发酵前期染菌：发酵前期最易染菌，且危害最大。原因：发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌能力弱。在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。

染菌措施：可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱调pH值，缩短培养周期等措施予以补救。如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。第54页，共66页，2023年，2月20日，星期一55（3）发酵中期染菌：会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量产酸，培养液pH下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡沫。

措施：降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐，抑制杂菌。第55页，共66页，2023年，2月20日，星期一56（4）发酵后期染菌：发酵液内已积累大量的产物，特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响不大。如果染菌严重，又破坏性较大，可以提前放罐。第56页，共66页，2023年，2月20日，星期一1、防止种子带菌制备种子时对沙土管及摇瓶严格加以控制。沙土制备时要多次间歇灭菌注意接种时的无菌操作子瓶、母瓶的移种和培养无菌室和摇床间都要保持清洁。无菌室内要供给恒温恒湿的无菌空气，还要装紫外灯用以灭菌，或用化学药品灭菌。二.染菌的防止第57页，共66页，2023年，2月20日，星期一无菌室要求有紫外灯：打开紫外灯，照半小时，关灯后15分钟再接种。用消毒药水如新洁而灭擦桌子、拖地，开启超净台的通风，接种时必须在超净台上操作。超净台装有一台鼓风机，进风口有一粗过滤器，出风口有高效过滤器，保证无菌风从超净台吹出，外界有菌空气不可能进入接种区域，保证无菌条件。接种人员必须穿好无菌服，戴好口罩，手用酒精棉球擦干净。第58页，共66页，2023年，2月20日，星期一2．防止设备渗漏发酵设备及附件由于化学腐蚀、电化学腐蚀，物料与设备摩擦造成机械磨损以及加工制作不良等原因会导致设备及附件渗漏。设备上一旦渗漏，就会造成染菌，例如冷却盘管、夹套穿孔渗漏，有菌的冷却水便会通过漏孔而进入发酵罐中招致染菌。阀门渗漏也会使带菌的空气或水进入发酵罐而造成染菌。第59页，共66页，2023年，2月20日，星期一3．防止培养基灭菌不彻底培养基灭菌方法——高压蒸汽灭菌分批灭菌121℃，30分钟连续灭菌罐温125－130℃

，30－45分钟培养基灭菌前含有大量杂菌，灭菌时如果蒸汽压力不足，就达不到要求的温度；灭菌时产生大量泡沫或发酵罐中有污垢堆积，就会窝藏大量杂菌，造成灭菌不彻底。第60页，共66页，2023年，2月20日，星期一防止方法：缓慢开启蒸汽阀门，或加入少量消泡剂。灭菌时还会因设