植物生理指标检测方法

植物组织中可溶性糖含量的测定在作为养分物质主要是指可溶性糖和淀粉。它们在养分中的作用主要有：合成纤维素组成细胞壁；转化并组成其他有机物如核苷酸、核酸等；分解产物是其他很多有机物合成的原料，如糖在呼吸过程中形成的有机酸，可作为 NH 3的受体而转化为氨基酸；糖类作为呼吸基质，为作物的各种合成过程和各种生命活动供给了所需的能量。由于碳水化合物具有这些重要的作用，所以是养分中最根本的物质，也是需要量最多的一类。Ⅰ蒽酮法测定可溶性糖一、原理糖在浓硫酸作用下，可经脱水反响生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反响生成蓝绿色糠醛衍生物，在肯定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量测定。该法的特点是几乎可以测定全部的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖含量，而且可以测全部寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等〔由于反响液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反响〕，所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去很多麻烦，因此，有特别的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时，则应留意切勿将样品的未溶解残渣参加反响液中，不然会由于细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反响而增加了测定误差。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避开此种误差。糖类与蒽酮反响生成的有色物质在可见光区的吸取峰为620nm，故在此波长下进展比色。二、试验材料、试剂与仪器设备〔一〕试验材料任何植物鲜样或干样。〔二〕试剂80％乙醇。葡萄糖标准溶液〔100 μg/mL 〕：准确称取100 mg 分析纯无水葡萄糖，溶于蒸馏水并定容至 100mL10倍〔100μg/mL〕。3．蒽酮试剂：称取1.0g蒽酮，溶于80%浓硫酸〔将98%浓硫酸稀释，把浓硫酸缓缓参加到蒸馏水中〕1000mL2～3周。〔三〕仪器设备分光光度计，分析天平，离心管，离心机，恒温水浴，试管，三角瓶，移液管〔mL〕，剪刀，瓷盘，玻棒，水浴锅，电炉，漏斗，滤纸。三、试验步骤

5 、 1 、 0.5样品中可溶性糖的提取称取剪碎混匀的颖样品0.5～1.0g〔或干样粉末5～100mg〕，放入大试管中，参加15mL蒸馏水，在沸水浴中煮沸20min，取出冷却，过滤入100mL容量瓶中，用蒸馏水冲洗残渣数次，定容至刻度。标准曲线制作取60～5分别编号，按表24-1参加各试剂。试剂管号24-1试剂管号012345100μg/mL葡萄糖溶液〔mL〕00.20.40.60.81.0蒸馏水〔mL〕1.00.80.60.40.20蒽酮试剂〔mL〕5.05.05.05.05.05.0葡萄糖量〔μg〕020406080100将各管快速摇动混匀后，在沸水浴中煮10min，取出冷却，在620nm波长下，用空白调零测定光密度，以光密度为纵坐标，含葡萄糖量〔μg〕为横坐标绘制标准曲线。3．样品测定取待测样品提取液1.0mL5mL，同以上操作显色测定光密度。重复3次。四、结果计算溶性糖含量〔％〕＝从标准曲线查得糖的量〔μg〕×提取液体积〔ml〕×稀释倍数/[测定用样品液的体积(ml)×样品重量(g)×106]×100式中：C——从标准曲线查得葡萄糖量，μg。VT——,mL。V1——mL。W——样品重〔g〕。植物体内可溶性蛋白质含量的测定植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。在争论每一种酶的作用时，常以比活〔酶活力单位/mg蛋白〕表示酶活力大小及酶制剂纯度。因此，测定植物体内可溶性蛋白质是争论酶活的一个重要工程。常用测定方法有Lowry法和考马斯亮蓝G-250染料结合法。本试验将分别介绍这两种方法。1．考马斯亮蓝法一、试验原理考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸取在465nm。在肯定蛋白质浓度范围内〔0-100

nm，后者在595μg/mL〕，蛋白质－色素结合物在595nmG-250结合在2 min左右的时间内到达平衡，完成反响格外快速，其结合物在室温下1h内保持稳定。该反响格外灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。二、试验材料、仪器和试剂材料小麦叶片或其他植物组织仪器设备mL10.5mL2mL1mL3支。试剂1000μg/mL100μg/mL。考马斯亮蓝G-250100mg考马斯亮蓝G-25050mL90%85%〔W/V〕磷酸100mL1000mL。此溶液在常温下可放置一个月。(3) 90%乙醇(4) 磷酸〔85%，W/V〕三、试验步骤：可溶性蛋白的提取0.5g5mL4oC50mmol/L，pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入10mL4oC10min15000rpm/min下冷冻25min，上清液即为过氧化物粗提液。4oC下保存备用。标准曲线的绘制(1) 0-100μg/mL标准曲线的制作60-100μg/mL1mL0.1mL，分10mL5mL考马斯亮蓝G-2502min后，595nm下比色，绘制标准曲线。 配制0-100μg/mL血清白蛋白液 管号123456100μg/mL牛血清蛋白量(mL)00.20.40.60.81.0蒸馏水量(mL)1.00.80.60.40.20蛋白质含量(mg)00.020.040.060.080.10(2)0-1000μg/mL标准曲线的制作610-20-1000μg/mL1mL〔1〕操作一样，0-1000μg/mL的标准曲线。配制0-1000μg/mL血清蛋白血液 管号7891011121000μg/mL牛血清白蛋白〔mL〕00.20.40.60.81.0蒸馏水量(mL)1.00.80.60.40.20蛋白质含量(mg)00.20.40.60.81.0样品提取液中蛋白质浓度的测定吸取样品提取液0.1 mL〔样品提取见各酶活测定〕，放入具塞刻度试管中〔设两个重复管〕，参加5mL考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min后在595nm下比色，记录吸光度值，通过标准曲线查得蛋白质含量。四、结果计算与分析C V样品蛋白质含量〔mg/g鲜重〕= aW式中C－查标准曲线所得每管蛋白质含量〔mg〕；V－提取液总体积〔mL〕；a－测定所取提取液体积〔mL〕；W－取样量〔g〕。叶绿素测定方法10.2g，放入容量瓶。250ml95%的乙醇。348-72小时，中间摇摆一次。〔保证各批次浸提时间全都〕CA=13.95*D665-6.88*D649CB=24.96*D649-7.32*D665C单位：mg/L叶绿素a=CA*0.05/2叶绿素b=CB*0.05/2CA=13.95*D665-6.88*D649CB=24.96*D649-7.32*D665C单位：mg/L叶绿素a=CA*0.05/2叶绿素b=CB*0.05/2叶C其他=(1000*D470-2.05*CA-114.8CB)/245叶绿素=C其他 其他*0.05/2总叶绿素含量为三者之和。一般叶绿素a/b3：14：1选择的波长不一样，计算公式就不一样，网上也有其他的波长方法，计算公式里的系数响应也有差异。淀粉含量的测定原理淀粉是由葡萄糖残基组成的多糖，在酸性条件下加热使其水解成葡萄糖，测定葡萄糖含量，依据葡萄糖含量换算成淀粉含量(C6H1O6n→(H1O5)n+nH2O625nm波长下的OD值与糖含量成正比。由于蒽酮试剂与糖反响的呈色强度随时间变化，故必需在反响后马上在同一时间内比色仪器用具和试剂仪器用具：移液枪、10ml离心管、试管、50ml容量瓶、试管架、棕色瓶〔>=500ml〕、螺口瓶〔>=500ml〕、烧杯、移液管〔连续加样器〕、离心机、分光光度计；试剂：葡萄糖标准液4Ⅰ：准确称取0.1000g蔗糖〔分析纯〕，于小烧杯中加水溶解，定容至100ml，加2-3滴浓H2S0，该溶液可长期保存；4葡萄糖标准液4Ⅱ:准确吸取1mg/ml的蔗糖标准液5ml，加水定容量50ml，得到浓度为0.1mg/ml蔗糖标准液；蒽酮溶液：100mg蒽酮溶于50ml浓H2S0〔化学纯〕中，避光保存，当天配制当天使用；3mol/LNaOH溶液：12g氢氧化钠溶于100ml蒸馏水；43mol/LHcl溶液：25ml浓盐酸与75ml蒸馏水混匀。测定方法植物淀粉相关溶液的提取：向测可溶性糖所剩残渣中参加7ml3mol/L的盐酸，在沸水浴中煮沸45分钟，取出冷却，4000转/分别心15分钟，取上清到50ml容量瓶中，参加7ml3mol/LNaOH，用蒸馏水定容到50ml，作为待测样品。标准曲线的配制：吸取0.1mg/ml葡萄糖标准液按下表参加至11支试管：0123456789100.1mg/ml葡糖(ml)00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.0蒸馏水(ml)20.90.80.70.60.50.40.30.20.10〔mg/ml〕00.010.020.030.040.050.060.070.080.090.1蒽酮试剂(ml)8.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.045℃水浴中显色10~15分钟，625nm处测OD值准确吸取待测液1.0ml，加蒽酮4.0ml，在45 ℃水浴中显色10-15分钟，各管在参加蒽酮试剂时要快速，加完后用力振荡混匀。625nm处测OD值，从标准曲线上得到提取液中可溶性总糖含量。结果计算葡萄糖糖含量〔%〕=标准曲线对应含糖量×定容体积×100／〔样品质量×显色吸取液体积×103〕粗淀粉含量〔%〕=葡萄糖含量×0.9强酸溶液，留意安全的测定一、试验原理超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD，EC1.15.1.1)普遍存在于动、植物体内，是一种去除超氧阴离子自由基的酶。本试验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的复原作用来确定酶活性大小。O在氧化物质存在下，核黄素可被光复原，被复原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生氧自由基·ˉ，O22可将氮蓝四唑复原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸取。而SOD可去除O·ˉ，从而抑制了甲腙的形成。于是光复原反响后，反响液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性的大小。2二、试验材料、仪器和试剂：材料小麦叶片或其他植物组织仪器设备(4000Lx)；试管或指形管数支。试剂1.50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.8)。2.130mmol/L甲硫氨酸(Met)1.9399gMet100mL。3.750μmol/L氮蓝四唑(NBT)0.06133gNBT100mL，避光保存。4.100μmol/LEDTA-Na20.03721gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000mL。5.20μmol/L0.0753g1000mL避光存。三、试验步骤：显色反响5mL指形管数支，测定管数目依据处理而定，另42依次参加以下各溶液比照0.25mL24000Lx20min左右，主要看颜色的变化，全部变成灰色，比照可能较浅。测定待反响完毕，以不照光的比照管做空白，依次测定其它各管的吸光值。2各溶液显色反响用量试剂(酶)用量(mL)终浓度(比色时)0.05mol/L磷酸缓冲液1.5130mmol/LMet溶液0.313mmol/L750μmol/LNBT溶液0.375μmol/L100μmol/LEDTA–Na2液0.310μmol/L20μmol/L核黄素0.32.0μmol/L酶液/缓冲液〔比照〕0.1比照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.2总体积3.0四、结果计算与分析SOD活性单位以抑制NBT光化复原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。SOD总活性[u/gFW)]

(AckAE)VT0.5AckWVtSOD比活力[u/mg()]

SOD总活性蛋白质含量式中：SOD总活性以酶单位每克鲜重表示。比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。Ack—照光比照管的吸光度。AE—样品管的吸光度。VT—样品液总体积，mL。Vt—测定时样品用量，mL。W—样品鲜重，g。蛋白质含量单位为mg/g。五、留意事项配好的Met4℃冰箱中保存备用，以防止Met活性损失。配好的NBT溶液须放入棕色，并在4℃冰箱中保存备用，以防止NBT见光分解。配好的核黄素溶液须放入棕色避光保存。六、思考题在SOD?影响本试验准确性的因素是什么?应如何抑制?试验六植物抗氧化酶活性的测定酶液的提取0.5g5mL4oC50mmol/L，pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入10mL4oC10min15000rpm/min下冷冻25min，上清液即为过氧化物粗提液。4oC下保存备用。1．过氧化氢酶(CAT)的活性测定HO2植物在逆境下或年轻时，由于体内活性氧代谢加强而导致H2O2累积。H2O2可以直接或间接地氧化细胞内的核酸、蛋白质等生物大分子，并使细胞膜患病损害，从而加速细胞的年轻和解体。过氧化氢酶可以HO22抗逆性亲热相关。一、试验原理2H2O2

在240nm波长下有强吸取，过氧化氢酶(Catalase,CAT,EC1.11.1.6)能分解过氧化氢，使反响溶液吸光度(A240)随反响时间而降低。依据测量吸光度的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。二、试验材料、仪器和试剂材料小麦叶片或其他植物组织仪器设备10mL3支，恒温水浴锅。试剂0.2mol/LpH7.8磷酸缓冲液(1%聚乙烯吡咯烷酮)。0.1mol/LH2O2(0.1mol/L高锰酸钾标定)。三、试验步骤：10mL32支为空白管将酶液煮死1剂。管号试剂(酶)管号试剂(酶)S0S1S2粗酶液(mL)0.20.20.2pH7.8磷酸缓冲液(mL)1.51.51.5蒸馏水(mL)1.01.01.02 25oC0.3mL0.1mol/L的HO12 240nm下测定吸光度，每隔lmin14min3支管全部测定完后，计算酶活性。四、结果计算与分析1minA2400.11个酶活单位(µ)。过氧化氢酶活性[u/(gmin)] 式中：ΔA240——AS0–(AS1+AS2)/2。

A240VT0.1V1tFWAS0——参加煮死酶液的比照管吸光度。A A ——A A ——S1 S2Vt——粗酶提取液总体积(mL)。V1——测定用粗酶液体积(mL)。FW——样品鲜重(g)。0.1——A240每下降0.1为1个酶活单位(µ)。t——加过氧化氢到最终一次读数时间(min)。留意：凡在240nm下有强吸取的物质对本试验有干扰。五、留意事项试剂中的H2O2的浓度对测定结果影响较大，要留意标定的准确性。缓冲液中必需加PVP，以防止酶活性降低。六、思考题影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些？超氧化物歧化酶(SOD)的测定七、试验原理超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD，EC1.15.1.1)普遍存在于动、植物体内，是一种去除超氧阴离子自由基的酶。本试验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的复原作用来确定酶活性大小。在氧化物质存在下，核黄素可被光复原，被复原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生氧自由基O2·ˉ，可将氮蓝四唑复原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸取。而SOD可去除O2·ˉ，从而抑制了甲腙的形成。于是光复原反响后，反响液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性的大小。八、试验材料、仪器和试剂：材料小麦叶片或其他植物组织仪器设备(4000Lx)；试管或指形管数支。试剂1.50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.8)。2.130mmol/L甲硫氨酸(Met)1.9399gMet100mL。3.750μmol/L氮蓝四唑(NBT)0.06133gNBT100mL，避光保存。4.100μmol/LEDTA-Na20.03721gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000mL。5.20μmol/L0.0753g1000mL避光存。九、试验步骤：显色反响5mL指形管数支，测定管数目依据处理而定，另42依次参加以下各溶液比照0.25mL24000Lx20min左右，主要看颜色的变化，全部变成灰色，比照可能较浅。测定待反响完毕，以不照光的比照管做空白，依次测定其它各管的吸光值。2各溶液显色反响用量试剂(酶)用量(mL)终浓度(比色时)0.05mol/L磷酸缓冲液3130mmol/LMet溶液0.613mmol/L750μmol/LNBT溶液0.675μmol/L100μmol/LEDTA–Na2液0.610μmol/L20μmol/L核黄素0.62.0μmol/L酶液0.1比照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.5总体积6.0十、结果计算与分析SOD活性单位以抑制NBT50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。SOD总活性[u/gFW)]

(AckAE)VT0.5AckWVtSOD比活力[u/mg()]

SOD总活性蛋白质含量式中：SOD总活性以酶单位每克鲜重表示。比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。Ack—照光比照管的吸光度。AE—样品管的吸光度。VT—样品液总体积，mL。Vt—测定时样品用量，mL。W—样品鲜重，g。蛋白质含量单位为mg/g。十一、 留意事项配好的Met4℃冰箱中保存备用，以防止Met活性损失。配好的NBT溶液须放入棕色，并在4℃冰箱中保存备用，以防止NBT见光分解。配好的核黄素溶液须放入棕色避光保存。十二、 思考题在SOD?影响本试验准确性的因素是什么?应如何抑制?3．过氧化物酶(POD)活性的测定一、试验原理过氧化物酶(peroxidases,POD,EC1.11.1.7)光合作用及生长素的氧化等有亲热关系，当植物受到环境胁迫时，酶活性就会发生变化。在过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470nm处有最大吸取，可用分光光度计470nm的吸光度变化，测定过氧化物酶活性。二、试验材料、仪器和试剂材料小麦叶片或其他植物组织仪器设备分光光度计，研钵，100mL容量瓶，吸管，离心机。试剂50mmol/L磷酸缓冲液pH7.0。30%613μL50mL，备用。含愈创木酚的混合液：取60.3μL50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)的烧杯中，置于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，用磷酸缓冲液pH7.0200mL，保存于冰箱中，备用。三、试验步骤1cm21只中参加水或磷酸缓冲液(pH7.0)50μl2.9mL和过氧化60μL150μL(如酶活性过高可稀释之)2.9mL和过氧化氢60μL，马上开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长470nm1min读数一次。四、结果计算与分析以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA470/[min·g(FW)]表示之。也可以用每分钟内A470变0.011个过氧化物酶活性单位(u)表示。[u/(gmin)]

A470VTWVs0.01t式中：ΔA470——反响时间内吸光度的变化。W——植物鲜重，g。VT——提取酶液总体积，mL。Vs——测定时取用酶液体积，mL。t——反响时间，min。五、留意事项愈创木酚的含量会影响测定结果，在配制愈创木酚溶液时，必需准确量取。H2O2须准确配制六、思考题在POD测定的过程中不设置比照对试验结果有无影响？为什么？淀粉酶活力的测定方法α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶，它们广泛存在于动物、植αβ-淀粉酶。-α-1,4糖苷键，单独使用时最终生Ca2+α-淀粉酶活化和稳定，它比较耐热但不耐酸，pH3.6以下可使其钝化。β-α-1,4糖苷键，遇到支链淀粉的α-1,6键时停顿。单独作用时β-淀粉酶是一种巯基酶，不需要Ca2+及Cl—等关心因子，pHα淀粉酶相反，它不耐热但觉耐酸，6015min可使其钝化。α-β-淀粉酶同时存在。可以先测定〔αβ〕淀粉酶总活力，然℃加热15minβ-α-淀粉酶活力，用总活力减去α-淀粉酶活力，就可求出β-淀粉酶活力。淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的复原糖与3,5-二硝基水杨酸的显色反响来测3,5-3--5-颜色的深浅与复原糖的量成正比。以每克样品在肯定时间内生成的复原糖〔麦芽糖〕量表示酶活大小。1酶活测定方法〔1〕标准曲线的制作(见下表)20ml具塞刻度试管,预先干净灭菌枯燥,编号,按表参加试剂。②摇匀,至沸水浴1标准麦芽糖溶液成分表及OD测定值,20ml,1号管作为空白调零点1标准麦芽糖溶液成分表及OD测定值试剂1234567〔mL〕00.20.61.01.41.82.0H2O〔mL〕2.01.81.41.00.60.203,5-二硝基水杨酸〔mL〕2.02.02.02.02.02.02.0〔mg〕00.20.61.01.41.82.0OD520(2)粗酶液淀粉酶活力测定①待测粗酶液的制备：24h4000r/min10min,65％饱和度的硫酸铵，待硫酸铵充分溶解后于4℃盐析2h，然后5000r/min离心20min，得到初步纯化的淀粉酶。②按以下挨次操作：取预先干净灭菌枯燥试管,1ml3ml605min1ml2%40℃水,5min,参加氢氧化钠溶液终止反响,20ml。→摇匀,用分OD520nm30min1mg麦芽糖所需的酶量为一个麦芽糖单位表示酶活性。酶活力测定公式：淀粉酶活力=麦芽糖含量〔mg〕·淀粉酶原液总体积〔mL〕/所加淀粉质量的时间间隔要确定全都：2样品酶活力测定步骤个〕样品稀释液〔个〕样品稀释液〔ml〕110蒸馏水605min001

样品〔重复3

标准空白〔ml〕6030min

1.5 1.5

1.5依次参加DNS 试剂〔ml〕

1.5 1.5 1.51005min0.4mol/LNaOH溶液终止反响〔ml〕

20 20 20反响后的试样在室温下静置10min，如消灭混浊需在离心机上以4,000rpm离心10min，520nm波特长测定样品空白〔A0〕和样品溶液〔A〕的吸光值，A－A0为实测吸光值。用直线回归方程计算样品淀粉酶的活性。2活性计算60℃、PH5.621mg1个酶活力单位〔U〕U按下式计算：×=U ×=S×〔30÷60〕×180U——样品淀粉酶活性，U/ml；K——标准曲线斜率；F——样品溶液反响前的总量，ml；60——160min；30——反响时间，min。试剂2%淀粉溶液0.4mol/L氢氧化钠pH5.6柠檬酸缓冲液称取柠檬酸20.01g1000mLA液。称取柠檬酸钠29.41g1000mLBA液13.7mL与B液26.3mL混匀，即为pH5.6之缓冲液。1g3,5-20mL1mol/L50mL蒸馏水，再参加30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100Ml，盖紧瓶塞，防止CO2进入。植物组织游离脯氨酸含量的测定原理：植物在逆境条件下，游离脯氨酸便会大量积存，且积存指数与植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。承受磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大削减了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态(干或鲜样)限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反响生成稳定520nm处有一最大吸取峰。脯氨酸浓度的凹凸在肯定范围内与其消光度成正比。材料、仪器设备及试剂1．材料：植物叶片(20m1)；具塞刻度试管(20m1)注射器或滴管(5～lOml)。试剂：(1)3％磺基水杨酸溶液(2)甲苯；(3)2.56mo1.L-l3:2混合，作为溶剂进展配制，此液在4℃下2～3天有效(4)脯氨酸标准溶液：准确称取25mg脯氨酸，用蒸馏水溶解250ml100ug.mL-l10ml，用蒸馏水稀释至lOOml10μg．mL-1的脯氨酸标准液。11取7支具塞刻度试管按表9.2-140mi。(2)5ml0号管匀比照在波长520nm下比色。〔3〕以消光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程9．2．1各试管中试剂参加量试管0123456脯氨酸标准溶液(m1)00．20．40．81．21．62．0水(m1)21．81．61．20．80．4 0冰乙酸(m1)222222 2茚三酮显色液(m1)样品测定333333 3〔1〕脯氨酸提取：取不同处理的剪碎混匀植物叶片0．2～0．5g(干样依据水分含量酌减)，分别置于大试5m13％磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球，于沸水浴中浸提10min。2m12m13m140min，下步操作按标准曲线制做方法进展甲苯萃取和比色〔向各管参加5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静0520nm下比色〕。结果计算：从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度脯氨酸含量的百分数。脯氨酸[μg.g-1(干或鲜重)](C．V)·(a·W)－1式中：C一提取液中脯氨酸浓度(PS)，由标准曲线求得： V－提取液总体积〔ml〕 A---测定时所吸取得体积〔ml〕 W 样品重〔g〕试验一植物激素的酶联免疫吸附测定法〔ELISA〕一、试验目的学习植物激素的ELISA测定原理，把握激素测定技术和样品提取方法。二、试验原理免疫测定的方法是利用抗原、抗体特异性反响而建立的，依据可视化方法的不同可分为：酶联免疫、放射免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定、生物发光免疫测定、浊度免疫测定法等。由于酶联免疫吸附分析法〔Enzyme-linkedImmunosorbentAssays,ELISA〕具有灵敏性高且快速、简便、本钱低廉、无放射性污染等特点，而日益被广泛应用于植物激素测定。目前，几大类植物激素IAA、ABA、GA3、GA4、iPA、ZR和DHZR等都建立了相应的ELISA方法并有试剂盒出售。ELISA是建立在两个重要的生物化学反响根底之上的，即抗原和抗体反响的高度专一性和敏感性；酶的高效催化特性。ELISA把这而这有机地结合在一起，即被分析物先与其相应的抗体或抗原反响，然后再检测抗体或抗原上酶标记物的活性，从而到达定性或定量测定的目的。ELISA依据均相、非均相以及竞争与非竞争可分为非竞争固相免疫测定、非竞争均相免疫测定、竞争均相、竞争固相测定。常用的免疫测定均为非竞争固相和竞争固相免疫测定统称为酶联免疫吸附测定。所用的吸附载体为聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯酶联板以及硝酸纤维素膜〔dot-ELISA〕等。目前植物激素的酶联免疫检测方法有三种形式〔见以下图〕：直接法，间接法和简化的间接法。〔利用游离抗原和酶标抗原与吸附的抗体进展竞争。Ab+H+HE=AbH+AbHE其中Ab表示抗体，H表示游离激素，HE表示酶标抗原。依据质量作用定律，当该反响体系中Ab及HEH越多，AbHAbHE形成的就越少，即结合在板上的酶标抗原就越少；反之游离H越少，AbH形成的就越少，而AbHE形成的就越多，即结合在板上的酶标抗原就越多。通过检测酶的活性，就可以确定游离H量的多少。间接法和简化的间接法是包被抗原〔间接法〕。利用游离抗原和吸附抗原与游离抗体进展竞争。间接法是竞争后，再参加二抗标记的酶，而简化的间接法是在竞争的同时就参加二抗标记的酶。Ab+H+HP=AbH+AbHP其中AbHHP表示吸附在板上的激素－蛋白质复合物当该反响体系中Ab及HP的量确定时，游离H越多，AbH形成的就越多，而AbHP形成的就越少，即结H越少，AbHAbHP形成的就越多，即结合在板上的抗体就越多。而板上的抗体可以与二抗标记的酶结合，检测酶的活性，就可以确定游离H量的多少。间接法直接法简化间接法三、试验材料、仪器和试剂材料颖植物材料仪器设备96量液体加样器〔10μL，40μL，200μL，1000μL〕，带盖瓷盘〔内铺湿纱布〕。试剂3包被缓冲液称取1.5gNa2CO3, 2.93gNaHCO3, 0.2gNaN〔可不加用量筒加1000mL蒸馏水，3pH9.6。磷酸盐缓冲液〔PBS〕：称取8.0gNaCl,0.2gKH2PO4, 2.96gNa2HPO4·12H2O，用量筒加1000mL蒸馏水，pH7.5。样品稀释液：500mLPBS0.1mLTween-20，0.5g明胶〔稍加热溶解〕。5.10gC6H8O7·H2O〔柠檬酸〕，18.43gNa2HPO4·12H2O1000mL蒸馏1mLTween-20，pH5.0。洗涤液：1000mLPBS1mLTween-20。终止液：2mol/L硫酸。提取液：801mmol/LBHT(二叔丁基对甲苯酚为抗氧化剂，先用100%甲醇溶解BHT，80%的浓度。否则BHT难溶解)。各激素包被抗原、各激素抗体、激素标准物和辣根过氧化物酶〔HRP〕标记的二抗〔间接和简化间接酶免疫测定用试剂〕。各激素抗体、激素标准物和各激素酶标物〔直接酶免疫测定用试剂〕。四、试验步骤样品中激素的提取称取0.5-1.0g〔假设取样后材料不能马上测定-2℃的低温冰箱中，2mL样品提取液，在冰浴下研磨成匀浆，转入10mL2mL提取液分次将研钵冲洗干净，一并转入试管中，摇匀后放置在4℃冰箱中。4℃下提取41000g离心15min试验中离心机型号LDZ5-4000rpm),1mL41h，离心，合并上清液并记录体积，残渣弃去。上清液过C-18固相萃取柱。具体步骤是：80%甲醇〔1mL〕平衡柱→上样→收集样品→移开样品后100%甲醇〔5mL〕洗柱→100%乙醚〔5mL〕洗柱→100%甲醇〔5mL〕洗柱→循环。5mL塑料离心管中，真空浓缩枯燥或用氮气吹干，除去提取液中的甲醇，用样品稀释液定容〔0.5g1.5-3.0mL左右样品稀释液定容〕。样品测定10mL包被缓冲液中参加肯定量的包被抗原〔最适稀释倍数见试剂盒标签〕，混匀，在酶标100μL。然后将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷盘内，置于373h。洗板：将包被好的板取出，放在室温下平衡。然后甩掉包被液，将下口瓶内的洗涤液通过乳胶管均匀0.5min,3次，将板内残留洗涤液在吸水纸上甩干。竞争：即加标准物、待测样和抗体。0.98mL20μL激素的标样试剂〔100μg/mL〕,2023ng/mL1000ng/mL,500ng/mL,250ng/mL,125ng/mL,62.5ng/mL，31.25ng/mL，15.625ng/mL，0ng/mL。将系列标准样参加96孔酶标板的前三行，每个浓度加3孔，每50μL，其余孔加待测样，每个样品重复三孔，每孔50μL。5mL样品稀释液中参加肯定量的抗体〔最适稀释倍数见试剂盒标签〕,混匀后每孔加50μL，然后将酶标板参加湿盒内开头竞争。370.5h。洗板：方法同包被之后的洗板。但要留意第一次参加洗涤液后要马上甩掉。然后再接着加其次次。目的是防止各孔的相互干扰。加二抗：将肯定量的酶标二抗，参加10mL样品稀释液中〔最适稀释倍数见试剂盒标签〕，混匀后，100μL370.5h。洗板：方法同竞争之后的洗板〔步骤4〕，洗五次，10-20mg邻苯二胺〔OPD〕10mL底物缓冲液中〔留神勿用手接触OPD〕，2-4μL30%H0。混匀，在每孔中加100μL〔在暗处操作〕，然后放入湿盒内，当显色22〔0ng/mL2023ng/mLOD1.0左右时50μL2mol/L硫酸终止反响。比色：在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物各浓度和各样品492nm处的OD值。五、结果计算与分析标准曲线用于ELISA结果计算最便利的是logit〔ng/mL的自然对数表示，纵坐标用各浓度显色值的logit值表示。Logit值的计算方法如下：B/B0 B0Logit〔B/B〕=ln————=ln————01-B/B0 B0-BB00ng/mL孔的显色值，B是其它浓度的显色值。作出的logit曲线在检测范围内应是直线。待测样品可依据其显色值的logit值从标准曲线计算出所含激素浓度〔ng/mL〕的自然对数，再经过反对数即可知其激素的浓度〔ng/mL〕。含量计算求得样品中激素的浓度后，样品中激素的含量〔ng/g·fw〕可用下式计算：N·V2·V3·BA=—————V1·W其中，A表示激素的含量〔ng/g·fw〕；V2表示提取样品后，上清液的总体积；V1当提取的上清液全部进展真空浓缩枯燥时V1与V2的体积是相等的〕V3表示真空浓缩后用样品稀释液定容的体积；W表示样品的鲜重；N表示样品中激素的浓度〔ng/mL〕；B表示样品的稀释倍数〔样品稀释液定容以后的稀释倍数〕。无菌技术与微生物分别培育一、 试验室的主要仪器和常用器皿介绍主要仪器天平、光学显微镜、干热灭菌用电烘箱、高压蒸气灭菌锅、培育箱、冰箱、摇床、离心pH计、水浴锅、细菌过滤器、磁力搅拌器等。常用玻璃器皿玻片、盖玻片其它器具接种环、接种针、接种钩、试管架、铝锅、染色缸、玻璃刮刀、洗瓶、注射器、酒精灯塞、滤纸、pH试纸、纱布、棉花、包扎绳。二、 一般光学显微镜观看细胞示范光学显微镜可区分大于0.2um的物体，有肯定的适用范围。假设有更高的试验要求可以选择扫描电子