生物化学教学课件：第一章 蛋白质

第一篇

生物大分子的结构与功能蛋白质protein核酸nucleicacid酶enzyme第一章

蛋白质的结构与功能proteinPro,Pr,P什么是蛋白质?蛋白质(protein)是由许多氨基酸(aminoacids)通过肽键(peptidebond)相连形成的高分子含氮化合物。蛋白质的生物学功能作为生物催化剂（酶）代谢调节作用免疫保护作用物质的转运和存储运动与支持的作用参与细胞间信息传递氧化供能

蛋白质是生物体的基本组成成分之一，几乎参与了生命活动的所有过程。含量：约占固体成分的近1/2（45%）

种类：一个真核细胞达数千种，每一种均有其特定的结构与功能分布广，含量高第一节蛋白质的分子组成碳、氢、氧、氮

、硫（C、H、O、N、S

）以及磷、铁、铜、锌、碘、硒元素组成:

蛋白质平均含氮量（N%）：16%∴蛋白质含量=含氮克数×6.25（凯氏定氮法）1/16%存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质(参与编码蛋白质的)的基本氨基酸仅有20种。一、基本组成单位——氨基酸(aminoacid,AA)H甘氨酸CH3丙氨酸L-氨基酸的通式RC+NH3COO-H1.

20种AA中除Pro外，与羧基相连的α-碳原子上都有一个氨基，因而称α-氨基酸。2.

不同的α-AA，其R侧链不同。氨基酸R侧链对蛋白质空间结构和理化性质有重要影响。3.

除Gly的R侧链为H原子外，其他AA的α-碳原子都是不对称碳原子，可形成不同的构型，因而具有旋光性。组成人体蛋白质的氨基酸都为L-α-AA（Gly,Pro除外）。二、氨基酸的分类按侧链的结构和理化性质可分为：

非极性、脂肪族氨基酸

极性、中性氨基酸

芳香族氨基酸

酸性氨基酸

碱性氨基酸甘氨酸

glycine

Gly

G

5.97丙氨酸

alanineAlaA

6.00缬氨酸

valineValV

5.96亮氨酸

leucine

LeuL

5.98

异亮氨酸

isoleucineIleI

6.02

苯丙氨酸

phenylalaninePheF

5.48脯氨酸

prolineProP

6.30亚氨基酸Phe脯氨酸Pro吡咯烷环--杂环氨基酸1.非极性脂肪族氨基酸(侧链含烃链的氨基酸)2.极性中性氨基酸(侧链有极性但不带电荷的氨基酸)3.芳香族氨基酸(侧链含芳香基团的氨基酸)TrpTyr天冬氨酸

asparticacidAspD

2.97

谷氨酸

glutamicacidGluE

3.22

赖氨酸

lysineLysK

9.74精氨酸

arginine

ArgR

10.76组氨酸

histidineHisH

7.595.碱性氨基酸εδγβδ-胍基咪唑基—杂环氨基酸δγβγβ4.酸性氨基酸芳香族氨基酸：含羟基氨基酸：含硫氨基酸：碱性氨基酸：酸性氨基酸亚氨基酸：支链氨基酸：Trp、Tyr、PheSer、Thr、TyrCys、MetHis、Arg、LysAsp、GluProVal、Leu、Ile几种特殊氨基酸

脯氨酸（亚氨基酸）

半胱氨酸+胱氨酸二硫键-HH修饰氨基酸：

蛋白质合成后通过修饰加工生成的氨基酸。没有相应的编码。如：胱氨酸、羟脯氨酸（Hyp）、羟赖氨酸（Hyl）。不构成人体蛋白的氨基酸：人体蛋白质中不存在的氨基酸。如：瓜氨酸、鸟氨酸、同型半胱氨酸，是代谢途径中产生的。1968年美国Dudrick，在研究人体营养学工作中，利用结晶氨基酸配出了氨基酸输液，挽救了很多病人的生命。用于大面积烧伤、创伤及严重感染等应激状态下肌肉分解代谢亢进、消化系统功能障碍、营养恶化及免疫功能下降的病人的营养支持，亦用于手术后病人，改善其营养状态。氨基酸营养输液是继“疫苗”、“维生素”、“抗生素”之后，被誉为二十世纪医疗史上的四个里程碑。

氨基酸注射液三、20种氨基酸具有共同或特异的理化性质两性解离及等电点氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。

等电点(isoelectricpoint,pI)

在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。1.

氨基酸具有两性解离的性质pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH<pI氨基酸的兼性离子阳离子阴离子

含有共轭双键的芳香族氨基酸Trp,Tyr的最大吸收峰在280nm波长附近。2.紫外吸收性质酪氨酸色氨酸波长nm苯丙氨酸02302402502602702802906543

该蓝紫色化合物在570nm波长处有最大吸收，可用于氨基酸的定量分析。3.茚三酮反应蓝紫色化合物（一）氨基酸通过肽键连接成肽肽键(peptidebond)是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。四、肽与肽键(peptideandpeptidebond)+-HOH甘氨酰甘氨酸肽键*

肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。*

两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽……*

肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。*

由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。氨基酸残基(residue)谷胱甘肽（glutathione,GSH）还原型氧化型γ-肽键(1)体内重要的还原剂保护蛋白质和酶分子中的巯基免遭氧化，使蛋白质处于活性状态。

(2)谷胱甘肽的巯基作用可以与致癌剂或药物等结合,从而阻断这些化合物与DNA、RNA或蛋白质结合，保护机体免遭毒性损害。促甲状腺素释放激素（3肽）

由下丘脑分泌，促进腺垂体分泌促甲状腺素。第二节蛋白质的分子结构

蛋白质是氨基酸通过肽键相连形成的具有三维结构的生物大分子。一般将蛋白质分子的结构分为四个层次来学习。Ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase蛋白质分子的结构层次一二一二

蛋白质的一级结构就是蛋白质多肽链中氨基酸残基的排列顺序。主要化学键是肽键，有的还包含二硫键。一、蛋白质的一级结构(primarystructure)一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。二、蛋白质的二级结构(secondarystructure)二级结构的主要结构单位——肽单元（peptideunit）二级结构的主要化学键——氢键(hydrogenbond)

*

蛋白质的二级结构是指多肽链中主链骨架原子的局部空间排布，不涉及氨基酸侧链的构象。

*稳定因素：氢键肽单元（peptideunit）参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所处的位置为反式(trans)构型，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元(peptideunit)

。

肽单元具有这样一些特性：

(1)早在1925年，Pauling等人就发现，肽键中的C-N比相邻的C-N单键短，而较一般C=N双键长。可见，肽键中-C-N-键的性质介于单、双键之间，具有部分双键的性质，因而不能旋转，这就将其固定在一个平面之内。

(2)肽键平面

肽键的C及N周围三个键角之和均为360°，说明都处于一个平面上，也就是说肽单元的六个原子基本上同处于一个平面，是一个刚性平面，这就是肽平面。

(3)肽键中的C-N既然具有双键性质，就会有顺反不同的立体异构，已证实肽单元两个α-碳原子呈反向分布。α-螺旋

(α-helix)β-折叠(β-pleatedsheet)β-转角

(β–turnorβ-bend)无规卷曲

(randomcoil)肽链中能够旋转的只有α-碳原子所形成的单键，肽单元上Cα所连的两个单键的旋转角度，决定两个相连肽单元的相对空间位置，肽平面成为肽链盘曲折叠的基本单位。由于肽平面和氨基酸残基侧链R基对多肽链构象的限制作用，二级结构只有以下几种主要形式：常见的蛋白质二级结构①多个肽平面通过Cα的旋转，相互之间紧密盘曲成稳固的右手螺旋。

α-helix

② 主链螺旋上升，每3.6个氨基酸残基上升一圈，螺距0.54nm。肽平面和螺旋长轴平行。α-helix

③相邻两圈螺旋之间借肽键中羰基氧(C＝O)和亚氨基氢(NH)形成许多链内氢键，即每一个氨基酸残基中的亚氨基氢和前面相隔三个残基的羰基氧之间形成氢键，这是稳定α-螺旋的主要化学键。α-helix

④肽链中氨基酸残基侧链R基，分布在螺旋外侧，其形状、大小及电荷均会影响α-螺旋的形成。α-helix

①是肽链相当伸展的结构，肽平面之间折叠成锯齿状，相邻肽平面间呈110°角。

②依靠两条肽链或一条肽链内的两段肽链间的羰基氧与亚氨基氢形成氢键，使构象稳定。也就是说，氢键是稳定β-折叠的主要化学键。

β-pleatedsheet

③两段肽链可以是平行的，也可以是反平行的。即前者两条链从N端到C端是同方向的，后者是反方向的。β-折叠结构的形式十分多样，正、反平行还可以相互交替。平行的β-折叠结构中，两个残基的间距为0.65nm；反平行的β-折叠结构，则间距为0.7nm。

④氨基酸残基的侧链R基分布在片层的上方或下方。β–turn蛋白质分子中，肽链经常会出现180°的回折，在这种回折角处的构象就是β-转角(β-turn)或称β-折角(β-bend)。

β-转角中，第一个氨基酸残基的羰基氧与第四个残基的亚氨基氢形成氢键，从而使结构稳定。氢键

无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。“无规卷曲”也像其它二级结构那样是明确而稳定的结构，但是它们受氨基酸残基侧链R基相互作用的影响很大。这类结构经常构成酶活性部位和其它蛋白质特异的功能部位。Randomcoil

许多蛋白质分子中可以有二个或三个具有二级结构的肽段，在空间位置上相互接近，形成特殊的空间结构，称其为“模体”（motif）。模体是具有特殊功能的超二级结构-螺旋钙结合蛋白中结合钙离子的模体α-螺旋-β转角（或环）-α-螺旋模体链-β转角-链模体链-β转角-α-螺旋-β转角-链模体模体常见的形式锌指模体结构锌指模体存在于类固醇激素受体超家族和一些转录因子中，属DNA结合蛋白。锌指模体约由30个氨基酸残基组成。4个半胱氨酸残基或2个半胱氨酸残基和2个组氨酸残基与1个锌离子配价结合。其中前一对半胱氨酸残基与后一对半胱氨酸（或组氨酸）残基之间相隔12个氨基酸残基。锌指模体的-螺旋部分是与DNA结合的部位。Zn组氨酸残基半胱氨酸残基-折叠-折叠-螺旋ZnYKCGERSFVEKSALSRHQRVHKNCLZn三、蛋白质的三级结构(tertiarystructure)

蛋白质的三级结构是指多肽链在二级结构的基础上,由于氨基酸残基侧链R基的相互作用进一步盘曲或折迭而形成的特定构象。也就是整条多肽链中所有原子或基团在三维空间的排布位置。

肌红蛋白(myoglobin,Mb)一条长为153个氨基酸的多肽链和一个血红素辅基组成。共有8段-螺旋结构(A-H）功能:储存O2

蛋白质三级结构的形成和稳定主要靠次级键，包括氢键、盐键、疏水键以及范德华力等。此外，某些蛋白质中二硫键也起着重要的作用。二硫键

结构域(domain):大分子蛋白质三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，各自折叠得较为紧密，并且行使各自的功能。

分子伴侣分子伴侣(chaperon)可以帮助蛋白质正确折叠：通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构。*帮助形成正确的高级结构*使错误聚集的肽段解聚，再诱导其正确折叠。*帮助形成二硫键热休克蛋白Heatshockproteins,

HSPs

帮助新生蛋白质的正确折叠、装配、跨膜运输和转位，阻止蛋白质的变性和聚集；参与错误折叠的蛋白质的水解，抑制错误折叠的蛋白质的分泌。四、蛋白质的四级结构（quaternarystructure）血红蛋白四级结构示意图

主要稳定因素：氢键、离子键

由两个或两个以上亚基之间彼此以非共价键相互作用形成的更为复杂的空间构象，称为蛋白质的四级结构。血红蛋白结构示意图蛋白质的结构

按组成成分：

单纯蛋白（仅含氨基酸）结合蛋白（单纯蛋白+辅基）

按形状分：球蛋白纤维蛋白五、蛋白质的分类第三节蛋白质结构与功能的关系一、蛋白质的一级结构与功能的关系

蛋白质一级结构是空间结构的基础蛋白质的一级结构决定蛋白质空间结构，进而决定蛋白质的生物学功能。天然状态，有催化活性尿素、β-巯基乙醇去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态,无活性Anfinsen经典实验核糖核酸酶2.相似的一级结构有相同或相似的生物学功能镰刀状红细胞性贫血:β亚基N端的第6位氨基酸残基发生了改变，Glu→Val,这种变异来源于基因上遗传信息的突变。正常DNA……TGTGGGCTTCTTTTT

mRNA……ACACCCGAAGAAAAA

HbAN端SerProGlu

GluLys异常DNA……TGTGGGCATCTTTTTmRNA……ACACCCGUAGAAAAA

HbSN端SerProVal

GluLys

分子病：蛋白质分子发生变异所导致的疾病3.一级结构关键部位的改变影响其生物学活性镰刀型红细胞正常红细胞在氧张力低的毛细血管区，HbS形成管状凝胶结构（如棒状结构），导致红细胞扭曲成镰刀状。这种僵硬的镰状红细胞不能通过毛细血管，加上HbS的凝胶化使血液的黏滞度增大，阻塞毛细血管，引起局部组织器官缺血缺氧，产生脾肿大、胸腹、肌肉疼痛等临床表现。肌红蛋白（myoglobin,Mb）单体，153AA血红蛋白（hemoglubin,Hb）四聚体，

α2β2(α2γ2,α2ε2)α:141AA,β(γ,ε):146AA二、蛋白质空间结构与功能的关系Mb与Hb氧合曲线的比较◆氧饱和度=×100%◆Mb与氧气有着高度亲和力，其曲线为双曲线。◆

与Mb相比，

Hb与氧气的亲和力较低。其曲线为S形曲线，表明Hb中各个亚基与氧气的亲和力不一致。Hb中第一个亚基与氧气结合后，将促进后续亚基与氧气的结合。这是由Hb的变构效应导致的。其作用在于使Hb能够更有效地运输氧气。

MbO2MbO2+Mb~1mmHgHb的变构效应也称别构效应

一个亚基与配体结合后，影响另一亚基与配体的结合能力。促进——正协同效应抑制——负协同效应协同效应蛋白质折叠病疯牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的具有传染性、遗传性的神经退行性病变。PrP是由染色体基因编码的分子量为33-35kD的蛋白质。动物和人的正常PrP水溶性强、对蛋白酶敏感，含有多个α-螺旋，称为PrPC。PrPC通过某种机制可转变成全为β-折叠的PrP(称为PrPSC)。PrPSC水溶性差、对蛋白酶耐受、热稳定、而且可以传染给其他个体，并致使其他个体中正常的PrPC通过某种机制重新折叠成PrPSC。最后PrPSC可以相互聚集，形成淀粉样沉淀而致病。

蛋白质是由氨基酸组成的大分子化合物，其理化性质一、蛋白质的理化性质

第四节蛋白质的理化性质及其分离纯化一部分与氨基酸相似，如两性电离及等电点、紫外吸收、呈色反应等。也有一部分又不同于氨基酸，如高分子量、胶体性质、沉淀、变性和凝固等。蛋白质的两性电离及等电点蛋白质的等电点（pI）

在某一溶液中，蛋白质所带正负电荷相等，净电荷为零时，此时该溶液的pH值即为该蛋白质的等电点(isoelectricpoint，pI)。蛋白质的吸收光谱及几种呈色反应蛋白质的特征紫外吸收光波长—280nm

（Trp、Tyr的贡献）2.呈色反应——常可用于蛋白质定量双缩脲反应(BiuretReaction)两个或两个以上的肽键在碱性条件下与Cu2+反应生成紫红色物质Folin-酚试剂反应蛋白质分子中的Tyr在碱性条件下与酚试剂生成蓝色化合物茚三酮反应蛋白质分子中的游离氨基和羧基与茚三酮加热生成蓝紫色化合物蛋白质的胶体性质

蛋白质分子量颇大，可自一万至百万之巨，故其分子的大小已达到胶粒1～100nm范围之内。因此蛋白质溶液具有胶体溶液的性质。稳定该亲水胶体的因素是：水化膜、颗粒表面电荷。+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉

天然蛋白质在某些物理或化学因素作用下，其特定的空间结构被破坏，从而导致理化性质改变和生物学活性的丧失，称为蛋白质的变性作用(denaturation)。变性主要是二硫键及非共价键的断裂，并不涉及一级结构氨基酸序列的改变。蛋白质的变性----吴宪最早提出

变性因素：加热、有机溶剂、强酸、强碱、重金属等蛋白质的沉淀

蛋白质变性后，疏水基团暴露，相互之间容易聚集而发生沉淀。值得注意的是，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。蛋白质变性的应用：利用：高温、高压灭菌利用：低温保存酶、疫苗等，防止蛋白质变性。

变性并非是不可逆的变化，当变性程度较轻时，如去除变性因素，有的蛋白质仍能恢复或部分恢复其原来的构象及功能，变性的可逆变化称为复性（renaturation）。

蛋白质的理化性质与特点：胶体性质；沉淀；变性与复性；凝固。分离与纯化就是利用蛋白质的理化性质和特点！蛋白质的分离和纯化盐析（saltprecipitation）：中性盐（硫酸铵等），分段盐析有机试剂沉淀：乙醇、丙酮，低温免疫沉淀：抗原-抗体

透析（dialysis）：半透膜层析（chromatography）：离子交换层析、亲和层析、凝胶柱层析离心、超速离心(ultracentrifugation)：沉降系数S电泳(electrophoresis):pI分子量的大小一、透析和超滤法可去除蛋白质溶液中的小分子化合物应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。透析(dialysis)超滤法利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。透析(dialysis):磁力搅拌器透析前透析后透析袋通过透析，小分子通透透析袋，散布于透析液中，大分子量的蛋白质不能通透透析袋，留在透析袋内。从而，蛋白质溶液中的小分子物质通过透析被分离除去。透析技术

在一定的压力下，使蛋白质溶液在通过一定孔径的超滤膜时，小分子量物质滤过，而大分子量的蛋白质被截留，从而达到分离纯化的目的。这种方法既可以纯化蛋白质，又可达到浓缩蛋白质溶液的目的。磁力搅拌器待超滤的蛋白质溶液加压的氮气超滤膜超滤（ultrafiltration）:二、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀是常用的蛋白质沉淀方法使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。盐析(saltprecipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。