氨基酸分析基本原理与应用

氨基酸分析基本原理与应用第1页，共27页，2023年，2月20日，星期五

目录一、氨基酸分析仪二、基本原理及特点三、样品的制备四、影响氨基酸分析的各种因素五、应用第2页，共27页，2023年，2月20日，星期五日立L-8900氨基酸分析仪第3页，共27页，2023年，2月20日，星期五（一）氨基酸分析仪的构成1、输液单元（泵与管路）2、进样单元（自动进样器）3、分离单元（离子交换柱、柱温箱）4、反应单元（反应柱、反应温度加热设备）5、检测单元（分光光度计）6、程序控制、数据处理（工作站）第4页，共27页，2023年，2月20日，星期五（二）氨基酸分析仪的特点1、高灵敏度：以蛋白水解液标准为例可检测到3pmoL。2、快速、高分辨率：水解氨基酸分析时间只有30分钟，生理体液110分钟。3、柱后衍生技术（实时混合）：与氨基酸反应前才将两种反应液进行实时混合，有效的延长了反应液的使用期限、且不需要额外的制冷装置存放。4、氨气排除系统：增加了除氨柱，能很好的排除氨在分析过程中对基线及峰形的干扰。第5页，共27页，2023年，2月20日，星期五二、基本原理氨基酸RHCCOOH__NH2__组成蛋白质的20种氨基酸除甘氨酸外、都有一个不对称碳原子，即а-碳原子。а-碳原子有四个不同取代基：羧基、氨基、氢原子和R基团，不同氨基酸的R基团不同。每种氨基酸有D-构型和L-构型，蛋白质中的氨基酸都是L-构型。第6页，共27页，2023年，2月20日，星期五（一）氨基酸的分类它的分类有两种：1、按氨基酸具有的酸性和碱性基团的多少分类：中性氨基酸、酸性氨基酸和碱性氨基酸。2、按人体营养的需求又可分为必需氨基酸、半必需氨基酸及非必需氨基酸。第7页，共27页，2023年，2月20日，星期五（二）氨基酸的化学反应与茚三酮反应：茚三酮与氨基酸一起加热，形成深兰紫色复合物，最大吸收波长为570nm。茚三酮与羟脯氨酸反应不释放NH3，直接生成黄色化合物，吸收波长在440nm。第8页，共27页，2023年，2月20日，星期五（三）氨基酸分析仪基本分析原理1、离子交换柱2、离子交换树脂3、离子交换原理第9页，共27页，2023年，2月20日，星期五1、离子交换柱氨基酸分析仪的中心部件就是离子交换柱，主要靠它把具有共性而又有差别的各种氨基酸混合物分离开来进行定量。日立氨基酸分析仪交换柱为磺酸型阳离子树脂分离柱。第10页，共27页，2023年，2月20日，星期五2、离子交换树脂用作氨基酸分离柱的固定相一般都是固体的合成离子交换剂。一般氨基酸分析仪所用的离子交换树脂是强酸型阳离子交换树脂，它是由苯乙烯和二乙烯聚合而成的。作为理想的离子交换剂应符合下列要求：机械强度好不溶解且具有很好的化学稳定性均匀球状颗粒当装入柱子后应有良好的通透性交换容量大离子交换基应是单一的官能性的第11页，共27页，2023年，2月20日，星期五3、离子交换原理缓冲液（流动相）中的样品离子与离子交换剂（固定相）间离子交换过程可分为以下几步：首先离子通过扩散作用，到达分离柱树脂的表面。（这个过程进行的非常快）离子进一步扩散到交换位置以致进入树脂内部交换位置。这决定于树脂的交联度和溶液的深度。这个过程是整个离子交换反应的关键。第12页，共27页，2023年，2月20日，星期五在交换位置上进行离子交换，这个平衡是瞬间的。被交换的离子带的电荷越多，它与树脂的结合越紧密，被其它离子取代就越困难。被交换的离子通过树脂扩散到表面。用洗脱液洗脱，被交换的离子扩散到溶液中去。第13页，共27页，2023年，2月20日，星期五氨基酸与树脂间的交换主要决定于带有相反电荷之间的引力作用。阳离子树脂本身带有负电荷，两者正负吸引而结合，并且氨基酸所带正电荷越多，结合得越紧密，被Na离子置换就越困难。所以，碱性氨基酸结合力最强，其次为芳香族氨基酸、中性氨基酸、酸性氨基酸结合力最弱。第14页，共27页，2023年，2月20日，星期五所以，用不同离子强度、PH值的缓冲液依次将氨基酸按吸附力的不同洗脱下来，被洗脱下来的氨基酸与茚三酮反应液在加热条件下反应（135℃），生成可在分光光度计中570nm的蓝紫色物质（仲氨生成浅黄色物质，440nm检测）外标法定量。第15页，共27页，2023年，2月20日，星期五（四）氨基酸分析仪与HPLC法的比较氨基酸分析仪

HPLC蛋白质水解物30min50min生理体液110min135min分离（苏/丝）95-98%85%检测限量3pmol100pmol定量精确度CV≤1.0%CV≤3%操作简单复杂第16页，共27页，2023年，2月20日，星期五三、样品的制备（一）蛋白质的水解（二）游离氨基酸样品的制备（三）生理体液样品的前处理第17页，共27页，2023年，2月20日，星期五（一）蛋白质的水解

用于全氨基酸测定的样品，凡是以蛋白质形式存在的都要进行水解处理，水解方法有三种：1、酸水解法：标准水解法，水解彻底，但色氨酸被破坏。2、碱水解法：用NaOH作为水解剂，色氨酸不被破坏，但有消旋作用，丝氨酸、苏氨酸等被破坏。3、酶水解法：水解条件温和，无需特殊设备，氨基酸不受破环，但水解时间长，而且不易水解完全。第18页，共27页，2023年，2月20日，星期五（二）游离氨基酸样品的制备游离氨基酸的样品在分析前必需进行磨碎、脱脂、提取、脱盐、去蛋白、脱色等处理。在进行分析前建议使用C18小柱处理一下。第19页，共27页，2023年，2月20日，星期五（三）生理体液样品的处理生理体液的样品首先要除去样品中的蛋白质，获得游离氨基酸。除去蛋白质化学方法为：

1、苦味酸法2、三氯乙酸法3、乙醇沉淀法4、磺基水杨酸法（常用的方法）第20页，共27页，2023年，2月20日，星期五四、影响氨基酸分析的各种因素样品中氨基酸浓度的影响缓冲液PH值、钠离子浓度的影响柱温的影响氨的影响氧的影响光源的影响（钨灯）第21页，共27页，2023年，2月20日，星期五（一）样品中氨基酸浓度的影响每种仪器都有其比较合适的进样量，进样浓度都有一定的范围。浓度太大太小都不适宜，尤其是将高浓度的样品注入仪器中会造成仪器管路的堵塞。最好进样分析前将样品稀释到比较合适的浓度。第22页，共27页，2023年，2月20日，星期五（二）缓冲液PH值与钠离子浓度的影响色谱图中各种氨基酸分离的特别好而没有峰丢失，缓冲液的PH值和钠离子起着重要的作用。如PH值和钠离子浓度不当会出现氨基酸出峰提前错后以及重叠现象。第23页，共27页，2023年，2月20日，星期五（三）柱温的影响柱温不稳定或不准确会出现基线漂移或分离度不好影响分离效果以及准确定量。第24页，共27页，2023年，2月20日，星期五（四）氨的影响缓冲液、样品、流路系统混入氨进可使基线在碱性氨基酸出峰处将基线抬高，影响碱性氨基酸分离效果和准确定量。第25页，共27页，2023年，2月20日，星期五（五）氧的影响反应液中的茚三