植物细胞培养与次级代谢产物制备

植物细胞培养与次级代谢产物制备第1页，共60页，2023年，2月20日，星期五第五章植物细胞培养根据培养规模:小规模培养和大批量培养；根据培养方式:悬浮培养、单细胞培养等；根据要求产物:用于诱变的细胞培养和生产次生产物的细胞培养。植物细胞培养（plantcellculture）是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养使其增殖获得细胞或细胞产物的技术。第2页，共60页，2023年，2月20日，星期五第一节植物细胞培养的特点植物细胞直径一般约为10-200μm，平均直径比微生物细胞大30-100倍。植物细胞通常以一定细胞数目的非均相细胞团方式存在于培养液中。植物细胞具有纤维素细胞壁和大的液泡，很容易被剪切力损伤。与微生物细胞相比，植物细胞生长速度慢，操作周期长，分批培养一般需要2-3周。第3页，共60页，2023年，2月20日，星期五植物细胞培养基成分丰富而复杂，适合微生物生长，因此防止污染更困难。植物细胞培养一般需要光照，通过光合作用合成有机物，因此氧气和CO2的含量与传递对细胞培养影响较大。第4页，共60页，2023年，2月20日，星期五与微生物细胞相比，植物细胞有什么特点？细菌，真菌、植物细胞都有细胞壁胞。细菌无成形的细胞核，真菌、植物细胞有成形的细胞核。细菌只有核糖体一种细胞器。植物细胞比微生物细胞大。生命活动与细胞分裂第5页，共60页，2023年，2月20日，星期五第二节植物细胞培养技术

1、植物细胞培养基

无机盐（大量、微量）

碳源（蔗糖）

有机氮源（水解酪蛋白）

有机酸、维生素

植物生长激素等第6页，共60页，2023年，2月20日，星期五（1）单细胞分离1、酶解法选择专一性水解酶在温和的条件下将植物细胞壁物质（纤维素果胶多糖）降解植物细胞壁物质，从而使细胞彼此分开，这种方法称为酶解法。经常采用的生物酶包括：纤维素酶、果胶酶、琼脂酶等生物酶。//机械法—外植体捣碎，然后过滤和离心。2、由植物培养组织（愈伤组织）中分离单细胞植物单细胞分离与小规模培养第7页，共60页，2023年，2月20日，星期五酶解法Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞加果胶酶过滤、离心第8页，共60页，2023年，2月20日，星期五由愈伤组织诱导分离单细胞茎段步骤：①诱导产生愈伤组织；②愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性；第9页，共60页，2023年，2月20日，星期五摇床用于振荡继代悬浮③（Suspensionculture)将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物120rpmculturetransfer1time/3d3weeks100-130目网过滤Centrifuge(离心）isolation第10页，共60页，2023年，2月20日，星期五（2）植物单细胞小规模培养看护培养饲养层培养技术细胞平板培养微室培养第11页，共60页，2023年，2月20日，星期五看护培养

概念：用一块愈伤组织或植物离体组织看护单细胞使其生长增殖的一种单细胞培养方法。第12页，共60页，2023年，2月20日，星期五第13页，共60页，2023年，2月20日，星期五饲养层培养

将饲养细胞先用射线辐射处理，使其失去活性，然后将饲养细胞和培养细胞混合植板，经过照射的细胞对于培养细胞能够起到一个饲养作用。第14页，共60页，2023年，2月20日，星期五双层滤纸植板培养方法培养基饲养层细胞看护滤纸层转移碟滤纸培养细胞第15页，共60页，2023年，2月20日，星期五第16页，共60页，2023年，2月20日，星期五概念：将制备好的单细胞悬浮液，按照一定的细胞密度，接种在1mm左右的薄层固体培养基上进行培养，称之为平板培养。

细胞平板培养法第17页，共60页，2023年，2月20日，星期五微室培养

概念：人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法，称微室培养。第18页，共60页，2023年，2月20日，星期五第19页，共60页，2023年，2月20日，星期五微室培养特点：

①能在显微镜下追踪单细胞分裂增殖形成细胞团的全过程。

②培养基少，营养和水分难以保持，pH值变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。

第20页，共60页，2023年，2月20日，星期五细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。

同一培养体系中，细胞不同步使悬浮细胞的分裂、代谢以及生理、生化状态等更趋复杂化，所以人们一直希望通过一定的技术途径，使同一培养体系中的细胞能保持相对一致的细胞学和生理学状态。细胞的同步化培养第21页，共60页，2023年，2月20日，星期五①体积选择法：用大、小孔径筛网过滤、收集单细胞。②冷/低温处理法：4℃低温下处理几天使细胞同步化后，再添加新的培养液培养。③饥饿法：控制营养液浓度，通过饥饿使细胞达到同步化，再添加营养液培养。④抑制法：使用抑制剂如尿苷、5-氟脱氧尿苷、秋水仙素等使细胞达到同步化。第22页，共60页，2023年，2月20日，星期五无论何种细胞同步化处理，对细胞本身或多或少都有一定的伤害。如果处理的细胞没有足够的生活力，不仅不能获得理想的同步化效果，还可能造成细胞的大量死亡，因此在进行同步化处理之前，细胞必须进行充分的活化培养。用于处理的细胞系最好处于对数生长期。第23页，共60页，2023年，2月20日，星期五细胞系和细胞株细胞系和细胞株概念原代培养物经首次传代成功即称为细胞系（CellLine），因此细胞系可泛指一般可以传代的细胞。是以一种细胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群体。第24页，共60页，2023年，2月20日，星期五通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养细胞称为细胞株（CellStrain），也就是说，细胞株是用细胞系单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。第25页，共60页，2023年，2月20日，星期五细胞株筛选1、适合于工业化生产的细胞株必须满足以下条件：（1）分散性好，适合大规模悬浮培养。（2）均一性好，细胞大小、生理状态一致。（3）生长速度快培养周期短不易染菌。（4）目标产物含量高，容易分离提取。（5）细胞遗传稳定。2、适合工业生产用细胞株的一般筛选流程：（自学）3、细胞株定向富集驯化4、人工诱变筛选第26页，共60页，2023年，2月20日，星期五

5、细胞株保存⑴继代培养保存法悬浮培养的细胞通过每隔1—2周换液进行一次继代培养。这种方法适合于短期保种。⑵低温保存法一般选择5--10℃的温度下培养，每隔十天左右更换一次培养液。⑶冷冻保存包括低温保存（-20℃）、超低温保存（液氮-196℃）。第27页，共60页，2023年，2月20日，星期五植物细胞大规模悬浮培养(cellsuspensionculture)

(1)细胞悬浮培养的概念和意义悬浮培养是将单个游离细胞或小细胞团悬浮在液体培养基中进行培养增殖的技术。第28页，共60页，2023年，2月20日，星期五意义/优点细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。第29页，共60页，2023年，2月20日，星期五CellsuspensionPlantsArtificialseedsSecondaryproductsIsolationprotoplastsMutationselect细胞悬浮培养的应用第30页，共60页，2023年，2月20日，星期五细胞悬浮培养起始培养物的建立选择适宜的外植体：幼胚、胚轴、子叶是最常使用的外植体。选择适宜的培养基：较高浓度激素；必要的附加物质。愈伤组织的要求：松散性好、增殖快、再生能力强。第31页，共60页，2023年，2月20日，星期五建立细胞悬浮系第32页，共60页，2023年，2月20日，星期五悬浮细胞的生长与增殖悬浮培养与固体培养比较有三个优点：一是增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应；二是在振荡条件下可避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害；三是振荡培养可以适当改善气体的交换。第33页，共60页，2023年，2月20日，星期五悬浮培养细胞数目的增殖变化第34页，共60页，2023年，2月20日，星期五细胞生长各个时期的特点：

滞后期（延迟期）:细胞很少分裂，其长短与接种量、大小和继代时原种细胞所处的生长期有关；

对数生长期:细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长速率保持不变

直线生长期:细胞生长和发育最明显的时期

缓慢期:生长逐渐缓慢,培养液消耗将尽，有毒代谢物质增多，氧气减少；

静止/平台期:生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚至开始死亡。

衰亡期：细胞死亡速度加快，细胞开始快速自溶，死亡。

第35页，共60页，2023年，2月20日，星期五成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚至更短时间便可增加一倍。第36页，共60页，2023年，2月20日，星期五影响悬浮细胞生长的因素：

起始愈伤组织的质量：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。

接种细胞密度：接种初期的细胞密度过低往往使延迟期加长，悬浮细胞的起始密度一般在0.5～2.5×105个细胞/毫升，低于这一密度则会使细胞生长延迟。

培养条件：方式、温度、继代周期第37页，共60页，2023年，2月20日，星期五植物细胞悬浮培养的生物反应器—自学生物反应器是指用于高等生物细胞批量化培养的装置及其相应控制系统。机械搅拌式培养系统气升式反应器鼓泡式反应器第38页，共60页，2023年，2月20日，星期五植物细胞大规模培养，根据一个培养周期中是否添加培养基，可分为成批培养、连续培养、半连续培养方式等。成批培养（batchculture）:指在一个培养体积中，接种细胞和添加培养基后，中途不添加培养基也不更换培养基的方式。植物细胞规模化培养方式第39页，共60页，2023年，2月20日，星期五连续培养（continuousculture）:在培养过程中，不断地向反应器中添加培养基，同时以相同的流量从系统中取出培养液，从而维持培养系统的内在细胞密度、产物浓度以及物理状态相对平衡的培养方式。半连续培养（semi-continuousculture）:这是一种介于成批培养与连续培养之间的培养方式，其基本方法是在完成上述成批培养的一个周期后，只从反应器中取出大部分细胞悬液，保留小部分细胞悬液作为下一个培养周期的种子细胞，然后加入新鲜培养基进行培养。第40页，共60页，2023年，2月20日，星期五•植物细胞固定化需要采用固定剂，是一些多糖和多聚类化合物，常用的包括海藻酸盐、琼脂糖、卡拉胶等。1、海藻酸盐固定化在Ca2+离子等多价阳离子的存在下，海藻酸盐的羧基和Ca2+之间以离子键形成不溶于水的海藻酸钙，从而在细胞表面形成凝胶。如果采用磷酸、柠檬酸、EDTA等螯合剂处理将Ca2+离子除去，又能使胶体溶解释放出细胞。无菌空气入口玻璃瓶细胞和褐藻酸钠混合液 空气出口形成胶体颗粒的喷射口 隔滤板装有CaCl2溶液的烧瓶

植物细胞固定化方法海藻酸盐固定化细胞步骤第41页，共60页，2023年，2月20日，星期五

常用方法：（1）滴入法：将细胞悬浮液与灭菌的含NaCl的卡拉胶溶液混匀，然后滴入含中KCl的培养基中，使其分散成小颗粒。过滤、清洗颗粒后转入适当的培养基中进行培养。（2）模铸法：将细胞-卡拉胶溶液注入柱形铸模中形成颗粒。（3）两相法：将细胞-卡拉胶溶液与无菌豆油或石蜡油搅拌混匀，形成液滴置于冰浴中不断搅拌，凝固成均匀颗粒，再离心除去油相和大部分溶液。2、卡拉胶固定化第42页，共60页，2023年，2月20日，星期五

琼脂糖(Agarose)固定化：（1）凝块法：将细胞悬浮于灭菌的琼脂糖中，搅拌待凝结包埋细胞后，将凝块挤进无菌金属网中，使其分散成小颗粒。清洗颗粒后转入适当的培养基中进行培养。（2）模铸法：同卡拉胶法（3）两相法：同卡拉胶法

优点：与海藻酸盐、卡拉胶等固定化方法相比，不需要其它离 子来保证胶的稳定性。

不足：制得的颗粒较大、形状不规则。3、琼脂糖(Agarose)固定化第43页，共60页，2023年，2月20日，星期五

固定化后需要测定细胞存活率大小，方法有：（1）荧光染色观察法：根据活细胞对FDA（二乙酸荧光素）黄绿色荧光染料能被吸收，而死细胞无法吸收原理鉴定。（2）呼吸强度测定：

用氧电极法测定固定化细胞的呼吸强度判断存活率。（3）细胞生长速率的测定：

通过测定细胞的湿重或干重增加率反映细胞活性大小。固定化细胞活力测定第44页，共60页，2023年，2月20日，星期五第三节植物细胞培养生产次级代谢产物概述培养系统植物细胞规模培养技术要点提高细胞次生代谢产物的途径细胞规模化培养中的有关技术问题第45页，共60页，2023年，2月20日，星期五概述长期以来，植物一直是许多化学品的主要资源，特别在制药和食品加工业中更是不可缺少；据不完全统计，至少有20%左右的药物是由植物衍生而来，而且每年都有发现许多植物来源的新化合物。第46页，共60页，2023年，2月20日，星期五细胞代谢产物分为初级代谢产物、次级代谢产物。初级代谢产物（Primarymetabolites）是通过初级代谢产生的维持细胞生命活动必需的物质，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类等。次级代谢产物（Secondarymetabolites）是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。大多是分子结构比较复杂的小分子化合物，例如抗生素、激素、生物碱、毒素等。植物次生代谢产物次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢。第47页，共60页，2023年，2月20日，星期五不同种类的生物所产生的次级代谢产物不相同，它们可能积累在细胞内，也可能排到外环境中。由于次级代谢产物大多具有生物活性，因此是植物代谢产物研究的重点。第48页，共60页，2023年，2月20日，星期五

由于资源短缺和需求量增加，依靠从栽培植物提取天然的次级代谢产物途径很难满足人类需求，而利用植物细胞生物反应器大量培养次生代谢产物成为最有效途径。优点：减少耕地占用，不受季节、地域限制；可以排除病菌和害虫的影响(密闭无菌操作)；可通过选择优良株系和优化培养条件提高代谢物产量；能通过改造生物合成途径获得新有用物质。第49页，共60页，2023年，2月20日，星期五植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义

李时珍（1593）在《本草纲目》中所开列的1892种药物绝大多数是植物药物，目前仍有约25％的法定药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产物。

第50页，共60页，2023年，2月20日，星期五1、药用代谢产物

这是重要应用领域，包括生物碱、萜类、苷类、酮类等。例如，紫杉醇（Taxol）是从红豆杉属植物中分离得到的一种二萜烯类化合物，治疗乳腺癌、肺癌、卵巢癌等的药物。通过植物细胞培养技术生产有价值的次生代谢产物需求：仅美国每年就有50000名妇女患卵巢癌，每年需约24kg紫杉醇；还有约40000名妇女死于乳腺癌，年需求量将增至100kg。全世界每年需要500kg紫杉醇才能满足广大癌症患者需求。生产1kg紫杉醇需要砍伐60年生大树3000-4000棵。紫杉醇在树皮、嫩芽中含量最高。若光从树皮中提取紫杉，每年需砍伐150-200万棵左右的大树。第51页，共60页，2023年，2月20日，星期五2、天然食品和食品添加剂

如胡萝卜素、叶黄素、甜菊苷、辣椒素等，因为化学合成色素和甜味剂越来越受到担心和严格限制。3、杀虫剂和杀菌剂如利用万寿菊细胞生产噻吩烷，香草生产鱼藤酮杀虫剂。4、饲料、精细化工等产品如用培养的槡、榆等细胞，再加入大豆粉、糖、淀粉等可充足供应蚕养殖业的饲料。精细化工产品种类繁多（36类），附加值高，具有功能性或最终使用性。除上述医药、农药、添加剂外，还包括染料、涂料、香精、洗涤剂、化妆品、金属表面处理剂、芳香消臭剂等产品。第52页，共60页，2023年，2月20日，星期五产品成分用途年销售额/亿美元长春花碱（长春花）治疗白血病18～20（美国）阿吗灵循环系统障碍药5～25（全世界）奎宁（金鸡纳树）治疗疟疾5～10（美国）致热素杀虫剂20（全世界）毛地黄心脏病药20～55（美国）第53页，共60页，2023年，2月20日，星期五

植物次级代谢产物的生物合成聚酮途径：又称乙酸丙二酸途径，乙酰辅酶A通过直线式聚合生成脂肪酸和环状次级代谢产物。聚酮类化合物的合成。莽草酸途径：生物碱、类黄酮、香豆素等产物。甲戊二羟酸途径：又称甲瓦龙酸途径，合成萜类、甾体、蒽醌等产物。第54页，共60页，2023年，2月20日，星期五（1）细胞株植物不同部位的细胞产生次生代谢产物的能力是不同的，所以在进行植物细胞培养生产有价值的代谢产物时，必须弄清楚产物的合成部位，也就是应该考虑到不同部位来源细胞的特性。筛选出稳定、高产、生长速度快的细胞株是细胞大规模培养次生代谢产物的前提。缺乏适合的细胞株是目前许多代谢产物无法利用细胞培养生产的主要限制之一。细胞遗传特性植物次级代谢产物合成