植物原生质体的制备及融合卢文

原生质体的制备及融合生31卢文2003012377实验目的：学习植物原生质体的分离制备技术，观察原生质体形态。学习植物原生质体的融合技术，观察融合原生质体时其形态及变化。实验原理：详见讨论。实验用品：显微镜、擦镜纸、剪子、镊子、小平皿、吸管、直式漏斗、300目尼龙网、10ml离心管、载玻片、盖玻片。试剂：洗涤液：甘露醇 0.6MCaCl2·2H2O 8mMNaH2PO4·H2O 2mMpH=5.6酶混合液：纤维素酶 1%果胶酶 0.5-0.7%甘露醇 0.6MCaCl2·2H2O 8mMNaH2PO4·H2O 7mMMES 3mMpH=5.6PEG溶液：PEG-6000 40%CaCl2·2H2O 3.5mMKH2PO4·H2O 0.7mM葡萄糖 0.3mMpH=5.8高Ca，高pH洗涤液：CaCl2·2H2O 100mMTris 50mM山梨醇 100mMpH=10.5蔗糖溶液：20%实验步骤：原生体的制备将新鲜花瓣用蒸馏水洗干净，用滤纸吸干表面水分。用尖头镊剥去木料的下表皮或将其剪成小细条，加入几滴酶液恒温振荡半小时。酶解好的原生质体混合液经300目尼龙网过滤到10ml离心管，加入少量洗涤液定容至4ml，此时，未被酶解的大块组织留在尼龙网上。500rpm离心5分钟，弃去上清液，加洗涤液至约2ml吹打均匀。500rpm5min重复离心一次，彻底去除酶液。加8滴洗涤液，悬浮原生质体。镜检，检察原生质形态和浓度，看看是否有碎片，本试验中碎片较少，故未做蔗糖漂浮。PEG融合：在小平皿内各滴三滴原生质体悬液，静置沉淀。各缓缓滴加一滴PEG在其中两滴原生质体悬液上，在另一滴上滴加一滴高Ca2+高pH洗液。镜下观察，1-2分钟后，在原先加入PEG的一滴悬液上加入一滴高Ca2+高pH洗液。镜检，记录结果。实验结果：（详见附图）加样种类现象PEG视野中的原生质没有明显的大范围的聚集运动，但原本挨得很近的原生质迅速的融合。高Ca2+高pH视野中的原生质有大范围的聚集运动，过一段时间后逐渐有原生质融合现象。PEG+高Ca2+高pH视野中的原生质有大范围的聚集运动，并可以迅速融合，和只加高Ca2+高pH的对照组区别不是很明显。实验讨论：关于几种融合技术的讨论：物理融合技术：现在常用的物理融合技术有电融和和激光融合技术。电融和：Zimmermann在1978年首先采用电脉冲方法成功地诱导了细胞融合,开创了细胞融合技术的新局面。它实现了装置化,比病毒法,化学法操作起来方便些,物理参数易精确测量,重复性较好的优点。电融合法的过程可分为两步:①电介质电泳。在电融合槽的电极上输出一个正弦交流电,形成一个非均匀电场,细胞在非均匀电场中被极化,形成偶极子,细胞向高场强区移动。极化细胞在电介质电泳下相互接近时,由于偶极子相互作用,相互吸引,所以细胞在融合槽中排列成珠链状。为了形成细胞珠链,必须选择合适的交流电场强度,使细胞所受电场力大于引起布朗运动的随机力,为此,Schwen和Sher进行了理论分析,得出该电场强度的阈值。②瞬时可逆击穿细胞排成珠链状后,在电极上输出单个或多个方波脉冲。使细胞膜上产生可逆性小孔,导致细胞融合。关于电脉冲融合细胞机理,Zimmermann认为电融合过程的分子机制是:通过电泳,两细胞膜紧密接触,且膜表面的蛋白质分子分离,产生了无蛋白的类脂区。电脉冲作用时引起膜结构局部扰乱,出现小孔洞。而相对的脂双层间分子在范德瓦尔斯作用力下,形成脂分子桥,由于连接处的细胞膜表面曲率大,处于高张力状态,在热力学上是不稳定的,所以最终导致两细胞逐渐融合成一个圆形的大球状细胞。但SubrataBiswas于1999年报道,通过扫描电子显微镜(SEM)观察到两细胞膜间有膜突起物,细胞膜就是依靠这些微伸出物连接起来的,并没有观察到微小孔洞的存在。图1：电融和过程示意图。化学融合：现在普遍应用的化学融合方法是通过PEG进行介导的方法。PEG融合：利用PEG介导的动物细胞融合，其实验原理到目前为止还没有完全定论。学者们一般认为，PEG改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相临的重排质膜在修复时相互合并在一起,使两细胞的胞质沟通,从而造成相互接触的细胞之间发生融合。现在的流行的假设有两种：一种时说PEG分子吸附在膜的表面，通过长分子的牵拉和吸附作用使原生质表面间形成分子桥面聚集；还有一种假设是说PEG分子在膜表面的耗减，或者说脱离，产生的范德华力使细胞聚集以致融合。近来的一些实验通过对水溶液和PEG溶液中膜表面的粘滞性的精确测量指出在PEG中细胞表面的粘滞性更接近水溶液中的，而并非大量PEG中，由此间接支持了第二种假设。但是个人认为，这个假设是否成立还有待于更直接的实验证据。PEG法将病毒法诱导产生杂交细胞的频率由10-5提高到10-3。PEG诱导细胞融合的效果,同其相对分子质量大小及浓度高低、作用时间、PH值密切相关。PEG相对分子质量、浓度增大,促进细胞融合的能力提高了,但它对细胞的毒性也随之增大,故通常选相对分子质量在1000-6000,浓度在30%-50%的PEG,并且严格控制PEG的作用时间,减少它对细胞的毒性,PH值一般选在7.4--8.0之间。现在采用PEG时,一般是同时采用高pH值，高Ga2+浓度的溶液来促进细胞膜融合,或加入二甲基亚砜(DMSO)来提高PEG诱导细胞融合。特别是在低相对分子质量和较低浓度的PEG中,DMSO的效果更加突出。生物融合：现在普遍应用的生物融合方法是通过病毒介导的方法。病毒介导融合：副粘病毒科的病毒，如副流感病毒(Sendaivirus)和新城鸡瘟病毒，在其被膜中目前发现了两种糖蛋白。较大的一种具有粘附细胞和凝血的作用；较小的一种可介导病毒同宿主细胞融合,也可诱导细胞与细胞融合，称为融合蛋白(fusionprotein)。人工利用病毒诱导细胞融合即是利用病毒的这一特性,使用时先用紫外线将病毒灭活,稀释到一定浓度加入到细胞悬液中,诱导细胞融合。但病毒介导细胞融合方法在使用前需要病毒的繁殖与灭活，操作繁琐，如灭活不完全则易对实验人员造成伤害，因此现在一般不使用此方法。关于原生质制备的讨论植物原生质体分离期间所用细胞壁降解酶和高渗介质对细胞生理影响甚大其不良因素首先反应在膜的变化上。花生原生质体酶解脱壁后膜脂质过氧化产物丙二醛MDA含量升高导致了膜损伤且损伤程度随时间延长而明显增大损伤，其原因可能与自由基在酶解过程中的过量产生有关。有实验证明添加抗坏血酸(ASA)能降低MDA的积累未添加ASA时酶解初期过氧化物酶(POD)过氧化氢酶(CAT)活性上升说明原生质体存在各种抵御不良变化的机制但酶解时间加长POD活性下降添加ASA能使超氧化物歧化酶SOD活性明显上升。酶解过程中植物细胞自身存在着对原生质体膜受损的防御机制细胞中的SOD能催化O2-与HO歧化为O2和H2O2，H2O2又可被细胞中的POD、CAT催化转变为H2O和O2因而可起保护作用。花生原生质体酶解过程中POD、CAT活性均出现上升，但酶解时间过长会导致细胞部分受损，因此12h后POD活性又有所下降，而CAT活性在12h内仍一直上升是由于酶解使细胞部分受损后产生了生理生化环境的改变POD对这种改变比CAT敏感。实验表明酶解液中添加ASA后MDA含量明显下降，说明ASA抑制酶解过程对原生质体膜损伤的作用，而添加ASA后SOD活性明显上升，SOD能清除O2-抵御或减轻膜脂质过氧化对细胞造成的损伤。另外ASA本身直接参与O2-、H2O2等活性氧的清除，使细胞内物质和膜系统受到保护。因此酶解过程中添加ASA有利于原生质体的培养和再生。关于实验所用的四种溶液渗透压的讨论：洗涤液：此溶液为高渗溶液，因为在不断洗涤的过程中，用高渗的溶液使细胞有一些皱缩可以避免原生质在离心和洗涤的过程中破裂，产生碎片影响实验结果。酶混合液：此溶液为高渗溶液，因为在酶解的过程中，用高渗的溶液使原生质有一些皱缩可以避免原生质在酶解的过程中的破裂，可以保持原生质中的结构安全。PEG溶液：此溶液应为低渗溶液，使细胞稍微的鼓胀可以使细胞膜变薄，利于细胞融合的过程。高Ca，高pH洗涤液：此溶液也应为低渗溶液，理由同PEG溶液，利于细胞的融合。参考文献S.W.Huia.Useofpoly(ethyleneglycol)tocontrolcellaggregationandfusion.ColloidsandSurfacesB:Biointerfac