引物设计的几点重要原则

引物设计的几点重要原则(总5页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----2PCR11引物最好在模板cDNA的保守区内设计。NCBI种的同一基因，通过序列分析软件〔DNAman〕比对〔Alignment〕，各基因一样的序列就是该基因的保守区。引物长度一般在15~30碱基之间。18-27bp，38，由于过长会导74℃，TaqDNAGC40%~60%之间，Tm72℃。GC〔composition〕GCTm〔meltingtemperature〕是寡核苷酸，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动Tm5~10℃Tm=4〔G+C〕+2〔A+T〕估量引物的TmTm55~80℃，Tm72℃以使复性条件最正确。引物3′端要避开密码子的第3位。33易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。引物3′端不能选择A，最好选择T。3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的状况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的A、T3′端最好选择T。碱基要随机分布。引物序列在模板内应当没有相像性较高，尤其是3’端相像性较高的序列，否则简洁导致错误引发〔Falsepriming〕。降低引物与模板相像性的一种方法GC发。引物自身及引物之间不应存在互补序列。〔Hairpin〕使引物本身复性。这种二级构造会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物43′端的互补重叠以防止引物二聚体〔DimerCrossdimer〕4△G〔应小PCR不能正常进展。引物5′端和中间△G值应当相对较高，而3′端△G值较低。△GDNA5′端和中间△G而3′端△G值较低〔确定值不超过9〕的引物。引物3′端的△G值过高，简洁DNA〔不同位置的△GOligo6〕引物的5′端可以修饰，而3′端不行修饰。引物的5′端打算着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物DNA变、缺失突变序列；引入启动子序列等。3′端也不能有形成任何二级构造可能。扩增产物的单链不能形成二级构造。某些引物无效的主要缘由是扩增产物单链二级构造的影响，选择扩增片段时最好避开二级构造区域。用有关软件〔RNAstructure〕可以推测估量mRNA〔△G°〕小于mol7-deaza-2′-脱氧GTPdGTP引物应具有特异性。就可以进展下一步的试验了。附：值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，PCR，由于产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种状况只能退而求其次，尽量去满足条件。PCR计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：G.2)Tm=58-603〕GC=30-80%.52GC.正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；〔300bp〕。引物的退火温度要高，一般要在60度以上；要特别留意避开引物二聚体和非特异性扩增的存在。DNADNAPRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRESS做染料法最关键的就是查找到适宜的引物和做污染的预防工作。对于引物，你不简洁。BLAST有和其他物种或其他序列当中存在一样的序列，如和你的目标序列之外的序列一样的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。简介寡聚核苷酸引物的选择，通常是整个扩增反响成功的关键。所选的引物序列将Tm要物理参数。好的引物设计可以避开背景和非特异产物的产生，甚至在RNA-PCR中也能识别cDNA或基因组模板。引物设计也极大的影响扩增产量：假设使用设计粗糙的引物，产物将很少甚至没有；而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反响指数期的产量理论值。固然，即使有了好的引物，照旧需要进展Mg2+浓度，使用特别的共溶剂如二甲基亚砜、甲酰胺和甘油。PCR体“质量”〔由用户在程序参数中设定〕保证优于通过人工导出的引物。别位点或5’端的各种修饰，这种对引物的修饰不会阻碍PCR反响，而会在以后使用扩增子时发挥作用。根本PCR引物设计参数引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。特异性是指发生错误引发的频率。特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的PCR中一对引物扩增的产物与理论上成倍增长量的接近程度。①引物长度；PCRTm〔引物/模板双链体的解链温度〕几度的范围内，1824核苷酸链是有很好的序列特异性的。引物越长，扩增退火时被引发的模板越54℃的最短的引物，可获得最好的效率和特异性。总的来说，最好在特异性允许的范围内寻求安全性。每增加一个核苷酸，引物18时使合成的寡核苷酸链〔18～24聚物〕适用于多种试验条件仍不失为明智之举。②引物的二级构造包括引物自身二聚体、发卡构造、引物间二聚体等。这些因素会影响引物和模3’ΔGmol5’端的要求可适当放宽。引物自身形成3’3’端对引物-模板结合影响更大；影响发卡构造的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外，与茎环构造形式亦有很大的关3’末端有发卡构造的引物。GCTmPCRGC50％G+C20Tm56～62℃范围内，这可为有效退火供给足够热度。一对引物的GCTmTmTm也越大。假设承受太高的退火温度，TmGC量和Tm值的协调格外关键。一般来说，一对引物的Tm值相差尽量不超过2～3Tm，20T7RNAGC5’端添加无关序列不会影响引物特异序列的退火。有时候，引物中添455’端序列已经参加到模板中，计算得出的退火温度下进展其余的循环。在引物上添加限制酶位点时一个重要的考虑是大多数限制5’23基，这样就会增加引物的非模板特异序列的长度。长引物序列的另一个缺点是PCR20TmTm=4(G+C)+2(A+T)计算。而对于较Tm的PCR引物设计软件大多数都承受这种方式。⑤引物的3’末端核苷酸组成引3’末端最终5到6个核苷酸的错配应尽可能的少。假设3’末端的错配过多，通过降低反响的退火温度来补偿这种错配不会有什么效果，反响几乎注定要失3’末端的另一个问题是防止一对引物内的同源性。应特别留意引物3’末端。引物间的互补将导致不想要的引物双链体的消灭PCR3’末端的稳定性5ΔG。此值的大小对3’末端稳定性高，扩增效率更高，同时也更3’TTT,GC⑥PCRPCRPCR产物长度对扩增效率有影响。特定的应用状况下，PCR板材料。预期产物的特定长度常常取决于应用的需要。假设目的是建立测定特异DNA120～300bpDNA应具有好的特异性和高的产生效率，并含有能用于探针捕获杂交试验的足够信息。这一长度范围的产物可以通过承受两步扩增循环方法得到，从而削减扩增时间。其他PCR方法有不同的最正确产物长度。例如，通过定量的RNA-PCR检测基因表达时，产物应当足够大以便构成竞争性模板，这样，产物和竞争物都能250～750bpmRNA3’末端非以便使RNA特异的PCR产物与从污染DNA中产生的产物在大小上相区分。假设PCR的目的是克隆一个基因或cDNA的特异序列，产物的大小是依据具体应用预选的。在这里，计算机程序可以供给关于期望区域侧翼选择引物对的信息。在DNAmRNA5’3’末端非翻3．简并引物设计①设计简并引物时，肯定要检查靶扩增区域选定氨基酸遗传密码的简并度。很明显，我们期望选择简并度最低的氨基酸，到达提高特异性的目的。②充分留意物种对于密码子的偏好性，选择该物种使用频率高的密码子，以降低引物的简并性。③应努3’末端不要位于密码子的第三位。④在一些多义位置使用脱氧次黄嘌呤〔dI〕代替简并碱4．测序引物设计固然，测序引物的设计一般都由测序公司来完成，假设需要自己设计的话；那么除了依据上面所提到的引物设计通用标准外，还需要留意两点：①测序引物的特异性的标准把握应当更严格一些，也就是说设计时更优先考虑特异性。由于在测序反响中，假设引物与模板在非预期位置退火并引发链延长，会对结果对来很大的干扰甚至造成结果无法识读。②测序引