利用转基因植物修复汞污染环境的新技术

利用转基因植物修复汞污染环境的新技术摘要：随着工业的发展，大量的重金属污染物不断地排放到环境中，造成了日益严重的重金属污染，其中汞污染已成为人类面临的最严重的环境问题之一。作为植物修复技术的尝试，我们将细菌中的merA、merB、merT、merPHx基因经过序列改造，构建在植物基因表达载体上，转入高等植物烟草中，目的是促进土壤、水体和大气中汞污染物的控制。所获得的转基因植物分别吸收有机态、离子态和气态的汞，并且在植物体内转化其存在形态。通过多基因的联合作用，可以将高毒的有机汞转化为低毒的无机汞，也可以将不同形态的汞以离子态的形式积累在植物中。在营养液中附加不同浓度氯化甲基汞（methylmercurychloride,CH3HgCl）培养大米草，测定汞胁迫对植物生长发育、质膜透性、MDA含量和SOD酶活性的影响。测试结果表明，大米草能够将有机汞转化为无机汞，并且在体内超积累汞。植物对汞污染物的吸收、转化和积累作用为汞污染环境的修复提供了一条新的有效途径。关键词：植物修复，重金属目前，世界许多地区的大气、土壤以及水体中重金属含量已达到致毒水平（Nriagu1988,Nriagu和Pacyna1988）。重金属污染已日益成为威胁人类健康和影响人类生活质量的严重环境问题。自工业革命兴起以来,人类向环境中排放出大量污染物,目前全球每年的重金属排放量以指数级速率增长。以汞为例，据世界卫生组织（WHO）统计，全球每年有10,000吨汞排放到环境中（Jeanna，2000）。造成环境污染的重金属主要包括镉（Cd）、铬（Cr）、铜（Cu）、铅（Pb）、汞（Hg）、镍（Ni）及锌（Zn）等(USEPA1997)，其中汞污染已成为人类面临的最严重的环境问题之一。几个世纪以来，由于在化工、造纸、国防、冶金、石油燃料、医药等领域的广泛应用，大量的单质汞（Hg0）及汞离子（Hg2+）以工业“三废”（废气、废液、废渣）的形式排放到环境中。这些毒性相对较小的汞物质在土壤、淤泥中沉积后，被其中的厌氧性还原硫细菌转化为剧毒的甲基汞化合物并在食物链中富集。甲基汞（CH3Hg+）极易被食物链传递并具有很强的生物放大效应，例如，经水生生物食物链富集后，顶级消费群中浓度增长可高达百万倍(Elizabeth和Marinus2000)，但直到19世纪50~60年代日本Minamata海湾地区由于甲基汞污染而引起水俣病的流行才引起了人类对其毒性的认识。汞中毒常表现为运动性共济失调、感觉异常、感观紊乱、心血管萎缩等病症并对患者的脑、肾脏及发育的胎儿造成严重的损伤(Raskin和Ensley2000)。由于汞中毒所引起的损伤是无法治愈的，故而汞污染的治理已刻不容缓。另一方面，我国作为矿业大国，矿业“三废”（废气、废水和废渣）很多，生态环境的损坏非常严重。以贵州万山汞矿为例，自1950年建成投产至1995年45年间，共排放含汞烟尘废气202亿m3，含汞废水5192万t，炼汞炉渣947万t，采矿废石263万t。其“三废”之一废气排放含汞浓度109～304mg/m3，废水含汞0.09～11.86mg/L，废渣含汞0.5～1.35mg/kg，平均分别超标5449倍、236倍和214.5倍，通过“三废”形式排放到自然环境中的金属汞含量至少达250t。境内炼汞炉渣和坑道废石堆积如山，且点多面广，又基本没有任何维护措施，自然堆弃于境内河流源头的沟谷间，在12.5km2的矿区范围内，堆积体积达20万m3以上的渣堆就有8处，且均在海拔800m左右处。每遇大雨或暴雨，近500m的落差使得大量的含汞废水、炉渣、废石进入河道，污染水源和土壤。中国大型矿山联合企业—贵州汞矿，经过600余年的开采后，因资源枯竭，企业资不抵债，于2002年破产。我国贵州万山汞矿和陕西旬阳汞锑矿周围的老百姓深受其害，汞毒害的病例逐年增加。群众苦不堪言，怨声载道。贵州万山汞矿是我国众多矿山的缩影，大批矿山废弃地造成的环境污染问题严重地影响人民群众的身体健康，阻碍我国经济和社会的可持续发展，已到了非治理不可的地步了。汞是土壤、水和空气重金属污染的主要元素之一[1]，它以液态、蒸汽、离子、有机（如甲基汞）和颗粒态多种形态存在。在环境中，汞循环的途径包括物理化学过程和生物学过程。生物学过程在汞化合物的形态转化中起决定性作用。有些细菌将甲基汞转化为离子汞,有些细菌将离子汞转化为单质汞并使之挥发，还有一些细菌将离子汞转化为HgS等沉淀物,另外一些细菌将金属汞转化为离子汞。汞还能同粘土矿物、腐殖质、金属水合氧化物等结合为颗粒态汞。从本质上说，汞形态的生物学转化由生物体内的酶和蛋白质来完成的。长期以来，人们试图通过研究污染物的迁移环节（来源、扩散、分布、循环等）和转化环节（形态、反应、归宿等）发现细菌转化汞污染物形态的机制。但是，多种生物因子和环境因子的相互作用和纵横交错妨碍了人们对污染形态转化机制的深入了解，而传统的化学及物理化学方法无法解释由生物体代谢所主导的生态化学过程。人们急需了解控制汞代谢的内在动力和反应机制，包括酶促反应和影响酶促反应的调控机制。基因表达调控网络是生物体控制汞和其它污染物代谢的开关和调节器。近年来，随着分子生物学技术的发展，人们已经从众多细菌中陆续分离出与汞化合物形态转化有关的基因，如汞还原酶基因merA，甲基汞裂解酶基因merB，汞转运蛋白基因merT，金属硫蛋白基因MT。这些基因的发现和克隆为我们清晰、准确地了解汞代谢的生物化学机制创造了基本条件，同时也为汞污染物形态的生物学控制提供了科学基础。merA基因编码汞还原酶（HR），催化离子汞还原为金属汞的生物化学过程。merA基因的表达与否和表达强度直接关系到汞还原酶的有无和多少,而生物体内和介质中汞离子（底物）的状态和含量以及其它环境背景因子都会影响merA基因的表达。这种影响常常以激活或抑制基因表达的方式进行。因此，merA基因表达的调控是汞还原酶酶促反应强度的决定性因素。与merA基因不一样，merT基因所编码的蛋白负责汞离子在细胞内的转运，直接影响生物体内汞离子的积累或富集。merB基因编码有机汞裂解酶的合成，催化甲基汞裂解为离子汞的降解反应。生物体内甲基汞转化为离子汞的过程实际上是甲基汞的修复过程。MerPHx基因是一种汞的氧化酶基因，能够将空气中的单质汞氧化为离子态的汞。虽然merA、merB、merT、merPHx基因的生物学功能已经清楚，但是这些基因在植物体内表达的调控机理及其酶促反应机理还有待研究。植物是土壤中生物链的重要一环，利用植物潜在的修复作用治理已经污染的土壤是污染环境修复的重要方向。正因为如此，人们正在设法发掘重金属超富集的植物。遗憾的是，目前还没有汞超富集植物的报导。因此说，利用植物本身的修复功能对汞污染物进行修复还缺乏必要的物质基础。近年来，有人尝试将merA或merB基因导入植物，采用基因工程方法创造转基因植物，目的是转化汞的存在形态，修复有机汞或无机汞污染的土壤和水体。Meagher博士领导的研究小组首先在模式植物拟南芥上转移merA和merB基因，获得抗汞和挥发汞的转基因植物[4,5]。此后，申请者采用人工改造的merA基因和merB基因分别转化烟草，获得了高抗汞污染物和离子汞挥发的转基因烟草[6]。这些转基因植物对汞污染物有非常强的吸收能力，但是，merA基因和merB基因是如何调节植物对汞污染物的吸收目前还是一个迷。目前，merA基因和merB基因的转基因植物在美国已经进入实用阶段,这是迄今为止重金属植物修复方面最为成功的例子。植物对汞和其它重金属的吸收主要受土壤和本身特性的影响。根际是重金属由土壤进入植物体的主要界面，根际环境中pH和铁锰氧化物、根分泌物、丛枝菌根真菌等有关物质的特性对植物根系吸收重金属有重要影响。揭示重金属在转基因植物根际这一特殊环境中的行为及进入植物体过程的控制机制，并且利用植物本身的特性，定向转化汞污染物的形态，筛选超富集的转基因株系，以研究超积累植物修复汞污染的环境是本项研究的主要方向。转merB基因的烟草植株吸收毒性很大的有机汞，并且将有机汞转化为离子汞；转merA基因的烟草植株大量吸收离子态的汞化合物并转化成金属汞以汞蒸汽的形态挥发。这就带来一个有争议的问题，在用merA转基因植物吸收和降解土壤汞离子时，同时有金属汞的蒸汽挥发到大气中。尽管金属汞的毒性远远低于离子汞和有机汞，由转基因植物释放到大气中的蒸汽汞大大稀释，但是此举仍然会影响大气中汞的含量。为了高效控制环境中的汞污染物但同时防止汞形态转化过程中对大气环境所造成的负面效应，我们设计了一套汞污染物的控制方案：利用merA、merB转基因植物高效吸收土壤中有机汞和离子汞，并且将有机态的汞转化为离子汞，利用merPHx转基因植物使汽态的金属汞氧化为离子态汞，通过merT基因使汞污染物在植物组织内富集，成为汞的超富集植物。这样，通过超富集植物的大规模种植可以回收土壤、水体和大气中的汞污染物，达到缓解和控制环境中的汞污染。应当看到，人们对汞污染物生物修复的研究和应用还处在初始阶段，在确定汞污染修复途径和开发相关基因生物修复功能时，我们还需要回答许多重要问题：汞污染物在植物和土壤界面的存在形态，merA、merB、merT和MT基因表达的调控机制，基因表达产物-酶或蛋白质之间的相互作用，汞形态转化的酶促反应机理及其生物化学反应，转基因植物控制汞污染的效率，提高汞超富集水平的有效组合。研究和回答上述问题将使我们明确植物控制汞污染物转化的生态化学过程，了解复合污染条件下植物降解汞污染物的机理以及修复新原理，为重金属污染物的植物修复和联合修复提供科学依据。材料和方法ⅰ)植物材料.试验用烟草（Nicotianatabacum）品种为革新一号.采用常规方法消毒烟草种子，在MS培养基上播种.在组织培养条件下获得无菌苗，取25-30d苗龄的叶片作为遗传转化的受体材料.(ⅱ)菌种、质粒、工具酶.菌种包括大肠杆菌DH5α,农杆菌LBA4404为本实验室保存；质粒R8310为吕玉平博士赠送，实验所用的克隆载体为T-easy(Promega公司产品)、pBluescriptKS(+)；植物基因表达载体为pJR1.限制性内切酶、修饰酶购自华美生物工程公司.(ⅲ)引物设计、PCR扩增和载体构建.利用引物设计改造merB基因、merA、merT和merPHx基因的部分序列.在不改变其氨基酸序列的条件下增加A+T的含量.PCR产物克隆在T-easy载体中，随后亚克隆在pBluescriptKS(+)质粒中.将基因片段插入pJR1载体中，构建成表达载体.采用冻融法转入根癌农杆菌LBA4404.(ⅳ)遗传转化.烟草的转化参照叶盘法进行[7].将过夜培养的农杆菌离心，菌体用MS液体培养基10倍悬浮.将烟草叶片切成0.5×0.5cm的小块，放入菌液中浸泡10min，吸干多余的菌液后平放在MS+6-BA3mg/L的培养基预培养２d.然后转接到分化和筛选培养基（MS+6-BA3mg/L＋Km50mg/L＋羧苄青霉素Cb500mg/L）上，在25℃下共培养.等芽长到2cm高时，切下芽并转入生根培养基（1/2MS+NAA1mg/L+Cb300mg/L）上进行生根.待根长出后移栽到盆钵内，温室内培养至开花.每个转基因植株标记为一个转基因株系，按每个果实分别收获种子并编号.(ⅴ)转基因种子的卡那霉素抗性筛选.从转化植株上收获的种子经表面消毒后播种在含有45mg/L卡那霉素(Km)的1/2MS固体培养基上筛选，21天后挑出绿苗移栽于蛭石和珍珠岩的人工土中，使其在人工气候室中生长.回(飘ⅵ坛)卸汞抗性的测众定欣.宁以醋酸苯汞（殃PMA倍）代表有机餐汞塌.订在愁MS蜜培养基中加入啄PMA融，配制成不同份PMA肌、仙HgCl剑2榆浓度处理的培徒养基，将转基依因的种子经表型面消毒后播种泊在含汞挠的税M壳S味固体培养基上宪，在培养室内疏培百养蚊.让能够发芽且长剥出绿色真叶的穷种子认定为抗捆性种子，不解能萌发或发芽洞后心叶变白的伯种子视为不抗尼的种省子驱.道为了确认转基第因植株在苗期趁对汞的抗性，拦在种有烟草转婆基因苗的土壤含中加入环PMA暴，根据幼苗的著生长状况判断粉其抗腹性温.胶(惠ⅶ染)教Southe壤rn俊舞和绵Northe孔rn码杂孟交瓶.CTA棕B仔法盒[8]龟提取烟草转化惠植株杏总国DN镇A腰，用悠Eco慌R悲I执消耕化饰3揉小时后，逮在摘0.7最%谎琼脂糖凝胶上割电朴泳框.蒙将米DN映A向转移到尼龙膜谢（蕉Amersh舞a测m混）必上惕.住用鹰Xba顺Ⅰ牌／任Sal浮Ⅰ楚双酶切患pJR1::轰merBhe坏载体，得到，拳以偷32伍p-dCTP任为标记物合成态探针，在盟42探℃套预杂交四4洗小时，预杂交店缓冲液含有分25%叼甲酰胺、坟100叹μ趟g/ml催变性的鲑精折DNA调、丽10疑μ响g/ml狭酵母序RNA盒、望5烤×赴Denhar律d锦t沃’极s争试剂、课50mmo叶l/L龟磷酸钠询(pH6.乌5)办、借5伤×厘SSC劫和倒0.2%S车DS瞧.馅向预杂交缓冲早液中加入经过兵变性的探针，扇在同样的温度济下温因育凳24闻h罪.领在室温下用漂翼洗缓冲液（耻0.05mo扰l/LNa法H看2嫂PO斗4奉,0.05刚mol/L孤Na切2傅HPO贩4奔,5造×录SSC购和造25%婚甲酰胺）漂洗智杂交膜，然后形在俘42幕℃熄下用尖2达×沉SSC/0.绑02%SD那S挂继续漂洗悔.进滤膜烘干后加哈增感屏对垫X笑光片曝光匹.哄从转基因烟草孟和野生型烟草花的叶片中分别愿提取总龟RNA驼，以母32遥p-dCTP嗽为标记的盟merBhe序基因片段为探祝针进行志Northe猎rn样杂交晌[8]猛，杂交温度岸为伞5贼8铁℃掏.结果与分析蒙1训．转基因烟草鉴对无机汞的转孝化作用席在农杆菌的介拾导下，采用叶律盘法转化，不暗定芽诱导培养榴基为役MS+6-B氧A3mg弓/L坊＋冲Km50体mg/L灌＋达Cb眯500年mg/L,绕歼生根培养基为滩1/2MS凯+脱NAA塘1予mg/L宇+厌Cb圈300歇mg/L扔.庙在卡那霉素筛注选培养基上，落转桑接跨1毕4烧天后烟草叶片倦开始膨胀，增瓣厚，叶缘开始玉产生皱褶，并己有白色的愈伤旗组织生脱成呆.2珍2礼天后可见芽的女分叫化选.三此后，一部分扶再生芽变白而浑淘版汰吵.禾培养绿色再生剧芽失至凤2秀cm持左右后，进行匪生根培养腰，缘1鹰个月左右根系塌生长健壮，移茧栽到温室的盆其钵寻中奔.看本次实验得达到慕12黄0腐株再生苗，移钢栽成翼活冈8筝6缝株拔.颂盛每个转基因植晕株单独收种、斜编予号串.偿分别将人工改哨造的三MerA犯（辞MerApe誉9白）基因导入烟奏草（争Nicoti轰anata妙bacum均）。久Southe绝rn丸杂交和致Northe插rn怎杂交的结果显捞示，两个基因落已分别整合入茫烟草染色体中降，并且得到了渔表达。脆MerA惰pe9镇转基因植物的赌种子在厦50变μ柔MHgCl信2借的培养基上能贞够发芽，移栽贸后能正常的生遭长，其中裤10-20%律的转基因株系葬抗互HgCl帜2度，其种子在获350凶μ粪MHgCl题2辜的培养基上也共发芽。与此不师同，未转基因此的对照种子在膝50览μ泽MHgCl遇2聪的培养基上没炕有发芽。蝇利用汞汽测定鬼仪测定植株对昆汞离子的转化道作用，发现转静基因植株汽化口汞的速率高出突对照植株晶5-8着倍，根组织的芝汞汽化速率远倦高于叶和茎。兄这一结果显示拦，转基因植物凳的根杀系是汞汽化的或主要部位，汞具气不一定要通盐过维管束组织境在叶面上蒸发誓。根系不仅是衣汞吸收的场所锈，同时也是汞腿汽化的场所。采２．转基因烟朱草对有机汞的纸转化作用戚以质粒欢R8310斥为模板，采用挎上述正反义引宽物扩增，结果秤获得长度约炮为隐600雹bp筹的鱼PCR帜产裁物他.仪将该刺PCR礼产物克隆在尚T-easy劲载体上，经测姻序得到与预测住序列相同的糖merBhe冻基因裙,壳其中编码区悄为艺576墓bp莫.肥由于两个引物餐序列中骆G+C略的含量明显降劣低，所获得的翁merBhe粗基因的编码区轧更加符合真核滔生物的序列特检征靠.惕棵用魔Xba怕Ⅰ其/番Sal疯I禾酶切朵pBlues奇cript侍载体，得到洋merBhe烛基因的编码序庸列，以同样的赏酶切位点插入雨到消pJR1善双元载体中，腿构建成苗pJR1::料merBhe宽植物基因表达在载旬体辞.吗用冻融法将该僻载体转化到农泊杆菌塔LBA440顽4聚中翠.锤分别从转基因孟植株的叶片中粗提取总老DNA辰，以筐merBhe嘉基因的欧DNA厉片段为探针进惊行杂交，结果扛在疫4狗个夺DNA捷样品中有三个故转基因植株的翁DNA瞎样品显示杂交壁信瑞号赴.边搁其中招MerBhe啄-13国和斥MerBhe祸-14誓两个转基因植池株中起merBhe欠基因为单拷贝捉插墙入非.名从上述两个转览基因株系和野循生型烟草的叶贞片中分别提取愈总验RNA店，以振32盐p-dCTP华标记的姻merBhe固基因片断为探烤针进行拢Northe黎rn虚杂交，结果在碗MerBhe津-13还和馅MerBhe苏-14眠两个转基因株违系中均出现了熊杂交往带雪.速说明断merBhe站基因在该株系拍上得到了表冶达布.宜由于植物表达楼载体含有植物浮选择标记基因去NPTII(的新霉素磷酸转绵移酶基因负)贷，利用含卡那雷霉素的培养基料筛选种子，可命确定基因转化权率和转基因植饿株佩.乘为了解转基因帅植株抗卡那霉炮素和抗汞是否治同步，我们用阅含有卡那霉素茎、汞、卡那霉坊素带+员汞三种培养基身筛选转基因种筹子条.偶汞的筛选浓度咬采用烟草的致育死浓度，转界merBhe垒基因种子用称PMA陆0祥.豪5鸽μ裹M风筛选；卡那霉殿素的筛选浓度号为备50mg/倒L震.判MerBhe屑-13胁株系的种子群恶体中，抗卡那丝霉素和抗汞的法比例较高，几皮乎占所处理种悄子复的并2/倍3极；转MerBhe哥-14桃株系群体中，式抗卡那霉素和辛抗汞的比率较屡低，还不到所素处理种子发的御1/3馒.文在同时含有卡庭那霉素和址PMA秋的培养基上，己MerBhe农-13池株系中双抗幼嫁苗的比例接近阔单抗的比例，题而药MerBhe跑-14溉株系的双抗比缎例明显低于单土抗，说明有些娇抗卡那霉素的统植株并不抗月PMA饺，而有些抗汞诊的植株并不抗钥卡那霉被素番.村合同时导入负merBhe少和盈NP加T填Ⅱ帝基种因持.巴当卡那霉素抗剂性和汞抗性不侵一致时，最好冈的解释是，有泊些转基因植株须的鸡merBhe闸或蝇NP笨T决Ⅱ漆基因没有表达盐或表达水平很拢低盏.旬在含也有购0仇.5添μ背MPMA递的培养基上，跑野生型的烟草勒种子没有发芽沸，而转基因株拴系秩MerBhe筐-13捏和扎MerBhe杰-14光的种子发芽情测况基本正常，蒸并且能够正常惊生幅长说.愁势当孕PMA务浓度提高到钓1.0乘μ蹄M般时拦,镜转基因种子虽基然能够发芽和凯生长，但下胚轮轴和叶片的伸畏展开始出现异布常现象，表现子在有些下胚轴润短缩和倾斜，日叶片变小和扭肢曲牺.牌随着煌PMA踪浓度的升高，纲幼苗生长的异塞常程度增特加境.匆经系PMA抬初步筛选的械MerBhe备-13撞幼苗，移栽于寒盆钵土壤中，餐用含触PMA拥的营养液浇盲灌睁.段结果显示，野类生型烟草吩PMA达的死亡临界浓词度均统为壁0乳.1爆μ壁M巨，在此浓度下劳，幼苗培赞养欣5凝d尾后叶片开始发取黄并逐渐死谨亡望.峰与此不同，增MerBhe州-13哀幼苗在庭0.1偏μ烫MPMA语的条件下健康荐生象长涌.床随着译PMA数浓度的增大，纷生长开始受到复不同程度的抑意制，表现在叶吊片数的减少，娘株高的降低，考叶色变黄，根挣系变垄小卧.只其秧中暑2勿.非0熔μ府M顽时，植株的下胳部叶黄化死亡众，但上部叶仍倍为黄绿色，新证叶为淡绿色，义可维持生翼长该.郊PMA税浓度话为乞2.拨5盒μ且M顿时，全部叶黄猴化，但若在黄疗化时转入不含拦PMA玩的培养基中，凭经碰1镇个星期后，新右叶转绿，表明昂伤害可逆漠转箭.色熔3.模0浇μ轧M险的伤害出现得葛早，也不可草逆章.暖因此托，名2.准5智μ邻MPMA门是皱MerBhe那-13黑转基因株系的里致死临界浓度改，相比未转基但因的烟草幼苗既，抗汞性提高累了恶25孤倍卸.兽３．植物对有饲机汞的转化作源用灯在营养液中附语加不同浓度氯懂化甲基汞（责methyl足mercur领ychlo子ride,C铸H歇3骆HgCl野）培养大米草裕，测定汞胁迫愈对植物生长发落育、质膜透性情、伟MDA增含量换和娃SOD颜酶活性的影响从。测试结果表房明，大米草对忠有机汞耐性的哑阈值为跪2纺μ舍mol/L碑。敞植株体内同时应检测到有机汞芒和无机汞芹，旺珠其沸中狠47.5堪%方的压氯化甲基汞筹—肿Hg赢被转化为无机巡汞良，济42.5屿%戒为有机汞形式讨存在。无机汞山和有机汞较多渔地分配在根系枝中，茎叶中无沸机汞含量为根蚂系竿的纸70毙%计，无机汞浓度痒也仅为根系乖的往37牺.炊0敞%旦。根系中有机搬汞含量是茎叶坚含量骤的匆1毁.逮3滚3冶倍，有机汞浓瞧度是茎叶浓度比的威2畅.丸5宝倍。在汞的形巡态构成中，根里系中无机汞含萝量与有机汞含骤量的比例妥是桥2.忠5懒∶皆1奔，茎叶中则容为识2.希3袍∶杯1纠。结果表明，榜大米草能够将嫂有机汞转化为奋无机汞，并且抢在体内超积累蛇汞。里有机汞对大米都草植株的影响捎主要表现在导植物生长发育芦、质膜透性、理MDA中含量虫和些SOD侨酶活性的改变伶。针随着营养液中芒有机汞浓度的顶增加，植株的演地下部和地上罪部干物重都有撕不同程度的减教少，大米草对耽营养液中的有伏机汞表现出较浅强的耐性。有批机汞浓度近为巨1柴μ旅mol/L怠时，植株的形刑态和生长状况怠无明显改变；甜当氯化甲基汞港的浓度达本到灾2膛μ烛mol/L悠时，培馅养胳7本天的植株表现姥出轻微的失水葵萎焉状，当有呼机汞浓度增加违到萝3享μ柴mol/L楚时，培兄养翁7旅天就栽有明显的失水镰萎焉状，出现方轻微的受害症贼状，生长减缓红，培痰养牢1局4猴天后心叶呈淡层绿色，老叶叶材脉间有少量的筝黄色斑点；生叙长明显受阻，给心叶面积减小击，叶缘干枯，浪老叶均匀黄化骗。随着有机汞糟浓度的增加，河受害加重，心素叶停止生长，施老叶逐渐干枯怨脱落，根系萎预缩逢。替4缺μ它mol/L勇时地上部和地苗下部干物重分建别只有无汞胁凳迫时雄的端55.4双%条和煤65.7领%尘，叶绿素含量霉只有无汞胁迫忆时闷的别58.2贞%深。洗在含叔2孔μ致mol/L楼氯化甲基汞的所Hoagla散nd雄营养液中培支养鹿7谨天后，取烟草眠和大米草链各烟3弦株测定细胞膜能透性（电解质秋相对外渗率）眯、旨MDA条含量和单SOD榨活性。细胞质最膜透性增大、您细胞内部分电独解质外渗是非谢生物胁迫对植睁物伤害的主要性表现之一。大军米草的电解质昆相对外渗率小蔬于烟草，表明煌其在钉PMA碧胁迫下所受的最伤害小于对照艰。丙二醛（赏MDA仗）是常用的膜差脂过氧化指标毙，大米草的隔MDA后含量小于烟草燕，说明其在菜PMA要胁迫下膜脂过郑氧化程度小于怜烟草，受害程嗓度较轻。植物央受非生物胁迫泼伤害，细胞代岸谢失调，同时相，植物也有一稍些保护和适应长机制。保护酶愧系统就是植物披减轻胁迫伤害辜的机制之一。摄PMA掠胁迫下大米草肿的镜SOD臭活性高于烟草影，也表明其自壤身调节胁迫伤陕害的能力强于凯烟草。因此，露相比烟草，大孝米草逆在胖2叨μ摇mol/L任PMA缴胁迫下的伤害纽轻，耐性较强来。钢从各有机汞浓哄度处理间烟草受地上部和地下拾部干物重以及宵叶片叶绿素含模量的差异显著糕性分析看势，病1单μ取mol/L址与警2润μ汇mol/L吓有机汞浓度处万理间差异达极母显著水平（柴p御<隶0.01捐），因此替，方1煤μ剪mol/L腹可看作烟草对捎有机汞的耐性多浓度。同理，屑大米草对有机抗汞的耐性浓度上为胞2摔μ逼mol/L鲜。以大米草在含润有骨1L鸭2挡μ拐mol/L遭氯化甲基汞的丘营养液中培灯养影7悠天后，营养液白的体积变为床0.68腿L该，植株根和茎景叶的干重分别母为康72际.肤5田g痕和部136徐.偶4准g稀，根冠比誉为枣0.5昌3烘。根、茎叶、瓣营养液中无机鸟汞和有机汞浓偷度与含量见榴表漆2图。开始培养时贯，营养液中迫的畅0.4的mgPMA道—播Hg鉴是唯一的汞源恳，经财过请7议天的培养，在徐营养液和根、价茎、叶中不但叫检出了有机形宏态的汞，也有恳无机形态的汞荣检出。其中有甲机汞总量赞为破0.17摄mg少，为开始培养街时营养液中汞绢总量证的愿42.5协%馋，无机汞总量服为奇0.19嫩mg露，为开始培养斤时营养液中汞镇总量买的木47.5餐%愉。尚仿有累0.04李mg星未知形态的汞窑未检出，可能南是被培养箱所钢吸附，也可能孙是因汞挥发而伶损失。享由于营养液中把氯化甲基汞是队唯一的汞源，誓因此，大米草妇植株体内的无颜机汞是根系吸钱收的草PMA宅—组Hg焦转化而来，即破有膊42.5除%姑的稿PMA厅—宣Hg步被转化为无机墙汞并分布在植定株体内，其渴中根系中分锐配盗2匪5柔%橡，茎叶中分放配垄1颗7.内5轨%酷。可以看出，间大米草把大部蛛分的无机汞分返配在根系，根管系可耐较高浓刺度的无机汞，颠而茎叶中无机脱汞含量仅为根剧系怠的吧70顾%盛，无机汞浓度膨也仅为根系胁的们37爱.屯0得%陶。同样，有机辫汞也是较多地成分配在根系中式，根系中有机寻汞含量是茎叶怎含量瞧的帐1朵.菠3状3千倍，有机汞浓挠度是茎叶浓度云的亭2捕.抹5旁倍。在汞的形为态构成中，根覆系中无机汞含情量与有机汞含批量的比例苍是分2.洽5不∶译1偏，茎叶中则御为猎2.畜3难∶旺1岸。味大米草培男养割7毅天后，营养液青中也检测组到钟0维.贞03衫mg/kg逼的无机汞，这膝部分无机汞可泥能是根系分泌焰而来。营养液迈中无机汞含量芳与有机汞含量培的比例喂是脊5骗∶坟1溉。讨论峡植物修复技术乓(愚Phytor概emedia喇tion)冬是近年来发展究起来的一种绿阵色生态技术，框其中利用重金孔属超富集植物配(盆hypera聪ccumul根ator)黎进行修复是当箱前环境生物学点研究的热点领虫域，它是经济兵、有效的污染滋治理方法离[9]萄.丘目前已有逆Cd印、厉Co骆、辩Cr红、沈Cu祸、哑Mn舌、帮Ni雅、世Pb屯、总Zn新和哗As吊等超富集植物肢发现的报道，乎但相对而言植虑物不易富集汞揭，目前还没有思汞超富集植物屡的报纳道裁.瓶因此，利用汞塌的天然超富集充植物来吸收富册集，从而从环治境中排除汞的奸可能性很迎小芽.谨本文通过忽merBhe黄的修饰和转移荷，创造转基因项植物，结果得档到对有机汞表难现高抗作用的浸转基因系，这昂些转基因植物霞可用来吸收和赏转化污染环境煎中的有机汞，减是汞污染土壤贼治理的有效途顶径招.姨在转基因植物双体兄内从,穗merA韵基因的表达产懂物具有吸收和晕挥发离子汞的鼻解毒作用，这愁一点在转基因鼓拟南芥、北美姓鹅掌楸和烟草劳上得到了证实速[距4盈，前6吐，恢9-10]姜；与此同时，纺在转基因拟南购芥上熊merB孩基因将有机汞迁转化为无机汞匹[5]夏.康然而，龄merB尽转基因植物无壶法使无机汞挥哥发岂.段要使植物完成灿有机态的汞到穴气态汞的挥发奏，可以有两种墓选择：一是在减该植物中同时粘导入牺merA饮和序merB公两个基因，二幅是将铺merA乏转基因植株和跳merB燃转基因植株杂带交，其后代的次染色体组同时陡具有这两个基轰因圾.壮Bizily割等人将全merA疫和福merB偶转基因拟南芥恋作为父母本杂耻交，所获得的跟杂交后代同预麦期的一样能够豪将有机汞直接润转化为气态的村单质汞状[厘11掘]口.啄到目前为止，梳大多数汞解毒简的研究集中在烦转基因拟南芥钥上纤.记由于模式植物术拟南芥个体很孔小，不可能用惜于大规模的植扭物修纹复婆.单要采用植物修胖复的方法处理呈土壤和水体中受的汞污染，必搁须采用生物量渗较大的植赏物赴.珠在这方面，烟妹草是一种比较舰理想的植兵物琴.腹野生型的烟草宿植株由于缺乏改外源贡merB踢基因，无法有折效地转化醋酸佣苯汞，因此对夜醋旁酸苯汞表现出寸高度的敏感性辞，转基因烟草留之所以对醋酸每苯汞表现出抗榴性，是因为它协吸收醋酸苯汞缩，并且在六merB庙基因表达产物演的作用下将有塞机态的醋酸苯雄汞（有机汞）定转化为离子态刷的活汞直.头其结果是，植却株体内的离子棍汞浓度增加，恨植株本身也成赠为汞离子的超配富集载体。在骂我们的实验中纸，当醋酸苯汞第浓度为序0.5五μ吹M宗时，摊merB朗转基因烟草的巡出苗和生长是笨基本正常的，闹而野生型烟草菠不能发芽，说辞明此浓度下转症基因烟草对醋及酸苯汞表现出葡完全的抗性；唤随着醋酸苯汞落浓度的升高，拒转基因植株虽忌然能够生长，咸但受到越来越赞大的抑突制肌.敬这是因为，转除基因植株体内狸累积的离子汞筐不断增多，对锣植物组织的危鸦害程度逐渐增永强仍.桶同时因植株吸塔收岔醋酸苯汞也使含苯环的浓度增械加康.船植物体内的苯役环超过一定量票后也有可能对盲生长造成危罪害苗.索但是，在此类妈实验中，苯环叼的危害不是明艘显榴的它.吹Bizily烛等人用甲基汞也和醋酸苯汞筛弟选足merB晋转基因拟南芥霜，结果发现两器者的筛选效果绪是一致的嘴[5]掩.皂merBhe流转基因烟草对亭醋酸苯汞的抗艳性高达娱3.0陷μ摸M未，由些merBhe讯基因作用所产土生汞离子可以株进一步转化为啊低毒的单质汞说，这一过程有葱赖于超merA示基因的作篇用柿.晓在此之前，我纠们已获得汤merA婚转基因烟草，扁其植株对词印叠的抗性高朽达斧350霞μ知M送，鹊汞离子汽化水颤平高鼓达复40适0镇。这些结果表省明，悦mer康基因的导入使活烟草植株对有拨机汞和离子汞叔的抗性分别提罗高了至纹少睁3筝0掉倍镇和歼7德倍。将送merB展和村merA纠基因的作用结吗合起来，就可乞以使有机汞直阀接转化为气态早的单质汞。我苗们准备进行核merB党转基因烟草和捧merA栏转基因烟草的购杂交，获得既数含有忍merB帖基因又含有威merA领基因的转基因际杂算种藏.肝这样的烟草杂到种既能够将有附机态的醋酸苯缝汞转化为离子院态的汞，又能御够将离子汞汽步化为单质汞，否从而更有效地梨控制重金属汞糕的污扇染装.参考文献离1.Has把sett-S军ipple程B,Swa购rtout柱J,Sch逼oenyR错,Maha锹ffeyK头R,Ric犬eGE.痕Mercur隶yStud李yRepo冻rtto拢Congre桨ss:Vo兵lumeV阀:Heal卵thEff狗ectso妨fMerc符uryan悉dMerc粮uryCo胖mpound妇s.EPA页-452/R宜-97-00至7原.1997奥,U.S.之Envir铃onment静alPro姻tectio恐nAgen针cy:Wa虑shingt三on,DC筛.5:1励-349.折2.钥辈Harada辛M.Mi污namata娘Disea况se-M但ethylm俯ercury丧Poiso虹ningi恨nJapa隔nCaus墨edby慢Enviro赏nmenta谊l-Poll后ution哑.Crit做RevTo烧xicol坛1995;迹关25载:1-24爆.京3.没鹅Summer熟sAO,撤Biotra膏nsform讲ation支ofMer激curyC足ompoun少ds摩,in似Reduci豆ngRis示ksfro秀m续Enviro骄nmenta谈lChem届icals粒throug枕hBiot悬echnol底ogy祥,GOm选enn,E活ditor.央1988,光Plenu兽mPres软s:New浑York.悠RughC膨L,Wil蚂deHD,杨Stack历NM,T论hompso怠nDM,驾Summer崖sA