乙肝病毒cccDNA检测课件

乙型肝炎病毒cccDNA

——检测方法与应用价值一、几个相关问题简介什么是HBVcccDNA?即共价闭合环状DNA（covalentlyclosedcircularDNA)。乙肝病毒感染宿主细胞后在细胞内复制并建立感染状态，病毒松弛环状DNA（rcDNA）进入细胞核，利用宿主DNA聚合酶和拓扑酶等“修复”形成的、结构完整的、超螺旋双链DNA分子。乙型肝炎病毒的复制过程我们为什么要关注HBVcccDNA?cccDNA存在于细胞核内，成为乙肝病毒的复制“池”目前尚没有可以进入细胞核内，并能够清除cccDNA的药物，这也是现有抗病毒药物治疗效果不佳和治疗后容易复发的原因之一肝脏以外器官组织细胞可能存在cccDNA，成为肝脏移植术后乙肝复发的来源还没有稳定、可靠、敏感的cccDNA检测试剂盒问世为什么没有cccDNA检测试剂盒问世?·研究和开发该检测技术的时间不长·检测技术上的难度较大·前期研究主要集中于细胞模型和动物肝脏模，不能满足临床检验的需求·现有技术灵敏度不高，检测低限104copy/ml左右·分研究机构和学者对检测技术的特异性认识不足，存在缺陷cccDNArcDNA核酸一级结构完整的双链两条链均不完整核酸空间结构闭合环状，超螺旋松弛环状，非超螺旋是否与蛋白质结合不结合共价结合对某些核酸酶抗性强，不容易被降解弱，容易被降解分离cccDNA和rcDNA的分子基础分离cccDNA和rcDNA的任何手段均基于上述差异二、HBVcccDNA检测技术1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)2.侵入者探针法（Invaderassaay）3.嵌合引物荧光PCR法现有的几种cccDNA检测技术简介设计一对特殊引物：跨双缺口引物

正义引物P1：与负链互补结合，位于正链缺口上游反义引物P2：与正链互补结合，位于负链缺口下游目的：rcDNA不被扩增1.选择性PCR选择性PCR：rcDNA不被扩增选择性PCR：cccDNA能被扩增rcDNA被大量扩增，阳性结果不可靠，定量结果也不可靠

HepatologyResearch2003;15:234-243（PBMC）

WorldJGastroenterol2004;10(1):82-85(血清)

Kock等：反应管中rcDNA含量不能超过105copy

Hepatology

1996;23:405-413血清HBVrcDNA超过108copy/ml，进行荧光PCR可能会出现检测结果假阳性“选择性”PCR：并非万无一失与定性法比较增加了一个荧光探针，探针位于扩增片段区（负链缺口下游），与cccDNA的负链互补。选择性实时荧光定量PCR检测cccDNArcDNA不能被扩增无荧光信号EcoRI5‘+P1P23200(1)5‘3‘15903‘1820P118201590+3200（1）EcoRIP2cccDNA能被扩增检测到荧光信号选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA实时荧光定量PCR的原理实时荧光定量PCR的原理标准曲线方程YCt=42.0827-3.5554logXcopy

相关指数：

R2=0.995

灵敏度至少可以达到103copy/ml结果：选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA质粒标准品107copy/ml3.5×108copy/ml携带者血清质粒标准品105copy/ml105~107copy/ml携带者血清选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA解决方案特异性抽提分离cccDNA与其它形式的病毒DNA

采用沉淀法或质粒抽提试剂盒抽提法酶切纯化cccDNA

采用绿豆核酸酶或ATP依赖的plasmid-safeDNA酶选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA侵入者探针法定量检测cccDNA的优缺点优点：线性信号放大，特异性比荧光PCR法强缺点：灵敏度低：104copy/ml1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)2.侵入者分析法（Invaderassaay）嵌合引物荧光PCR法现有的几种cccDNA检测技术简介3.嵌合引物荧光PCR法Shao,etal.JVirolMethods2003；112：45-52+PNN：与HBVDNA非同源片段5’N5’3’3’p+rcDNAcccDNAPNNP25’3’5’3’3.嵌合引物荧光PCR法

嵌合引物荧光PCR的优缺点

优点：克服了荧光PCR法的部分缺陷，灵敏度比侵入法提高

缺点：仍不能完全避免待测标本中存在的rcDNA被非特异性扩增

无论是选择性荧光PCR，还是侵入者探针法或嵌合引物荧光PCR，本身都不能解决在高rcDNA背景条件下的假阳性问题，必须结合抽提分离、酶切纯化等步骤，以提高特异性。三、影响cccDNA池的因素1.cccDNA池的自身恒定cccDNA池：感染肝细胞核内HBVcccDNA的含量在无外来干扰的情况下保持恒定(5－50copy/cell)病毒自身调节：关于病毒的进化关于病毒的“思维”病毒自身的调节外来压力：打破病毒含量自身恒定的结果2.抗病毒药物对cccDNA的影响现有抗病毒药物，包括干扰素和各种核苷类似物，可以一过性地减少cccDNA，但均不能清除cccDNA细胞核内cccDNA含量的相对稳定性，决定了长疗程抗病毒治疗的必要性3.肝外组织也是cccDNA的储存池？·肝外组织细胞中HBV标志的存在情况：肾、胰腺、肺、心肌、心包膜、胃肠黏膜、皮肤、睾丸、前列腺、唾液腺等组织或细胞中均检测到HBV的标志物·HBV吸附？暂居？建立感染状态？依据：从上述组织细胞中检测到cccDNA，但必须解决检测技术问题(2)关于血清中是否存在cccDNA的问