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文档简介

第六章植物细胞融合(实验)一、细胞融合的目的和意义

细胞融合能实现远缘杂交。其意义在于打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限,有可能形成有性杂交方法无法获得的新型杂种植物,广泛组合各种基因型,扩大了遗传物质的重组范围。二、细胞融合(cellfusion)概念在外力(诱导剂或促融合剂)作用下,两个或两个以上的异源细胞或原生质体相互接触,从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象。

通过细胞培养技术,这个细胞有可能发育成完整的生物个体,这个杂种后代有可能兼有两个上代的一些优良性状。三、细胞融合技术原理和方法

由于体外培养的细胞很少会发生自发融合(融合频率大约在10-4~10-6之间),因此要采用生物、化学或物理的方法人为地促使细胞融合。

促细胞融合的方法有:

(一)病毒促进细胞融合

其中仙台病毒(HVJ)是最早用于动物细胞融合的融合剂。

(二)化学融合剂促进细胞融合

主要包括盐类融合剂、聚乙二醇(PEG)、二甲亚砜(DMSO)、甘油-醋酸酯、油酸盐、脂质、Ca2+配合物等。

(三)电处理融合法聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)融合

在众多的化学试剂中,PEG应用最为广泛,因PEG液比病毒更易制备和控制、活性稳定、使用方便、而且促进细胞融合的能力更强。PEG是一种多聚化合物。

在原生质体细胞膜与膜紧密接触的部位,膜内蛋白质颗粒易位并凝聚。接着可能是相邻的剥去蛋白质的细胞膜间的类脂质与类脂质反应。继之,类脂质分子的扰动和重排导致接触的细胞膜局部发生融合,形成很小的细胞质桥,之后它逐渐扩大,两个原生质体最终融合。

使用化学促融剂时,Ca2+是必需的。关于Ca2+的作用机理,有的认为是Ca2+和PO43-形成不溶于水的配合物,成为细胞间的钙桥,由此引起融合。也有解释为Ca2+结合到带负电磷脂的电离基上,使磷脂分子在膜上相互分离,由此引起融合。电融合(electrofusiontechnique)法:

电处理融合法是20世纪80年代发展起来的细胞融合技术,使融合率大为提高。电融合过程的分子机制:

是以电降解及双向电泳的联合作用为基础。通过电泳,两细胞膜紧密接触,且膜表面的蛋白质分子分离,产生了无蛋白的类脂区。电脉冲作用时引起膜结构局部扰乱,出现小孔洞。而相对的脂双层间分子在范德华力作用下,形成脂分子桥。由于连接处的细胞膜表面曲率大,处于高张力状态,在热力学上是不稳定的,所以最终导致两细胞逐渐融合成一个圆形的大球状细胞。AAlignment:Cellsarebroughtintoclosecontactbymeansofdielectrophoresis.BFusionpulse:Asquarewavepulseofamere15microsecondsisappliedinordertopermeatethemembrane.Themembranesthenfuse.CHeterokaryonphase:Thecellmembranesarefusedcompletelyandthecytoplasmhasmixedtogether.Onlythenucleiremainseparate.DEntirefusionproduct:Thenucleiarenowfusedaswell.Asarule,thenumberofchromosomesisreduced.

实际操作:

先把待融合的细胞或原生质体混合,取样置于100V/cm的高频交流电场中,在非均匀交流电场中形成项链状排列;

完整烟草原生质体(40×)

原生质体成串(40×)

再用1~5V/cm直流电脉冲/微秒冲击细胞或原生质体的粘接点,细胞膜降解造成若干微孔,于是在膜之间形成通道,使细胞质得以交换;最后导致新的球状细胞的形成。电融合法优点(与PEG法比较):

1、融合率高;

2、重复性强;

3、诱导仅发生在质膜接触部位,对细胞或原生质体伤害小;

4、融合是在同步状态下进行,活细胞数目多;

5、装置精巧,方法简单,可在显微镜下观察或录像融合过程;

6、免去PEG诱导后的洗涤过程,诱导过程可控制性强。Electrofusion2.试剂

1)酶混合液

配制分两部进行:

(1)将CaCl2.2H2O7mmol/L

NaH2PO4.2H2O0.7mmol/L

MES3mmol/L

甘露醇0.5mmol/L

用重蒸馏水溶解,调pH5.6,定容为酶储备液,灭菌备用。(2)使用时再加入:

纤维素酶R-100.8%

果胶酶R-101%

因酶制剂经过高压灭菌处理后会失活,故先将酶储液灭菌,待用时再将酶制剂按比例加入到第一步已灭菌的酶液内。2)配制CaCl2.2H2O0.16mol/L

(pH5.8-6.2用于悬浮原生质体)

3)PEG液:

30%(w/v)PEG(MW=6000)

CaCl2.2H2O0.01mol/L

kH2PO40.00074mol/L

山梨醇0.1mol/L

调pH5.8-6.2;用时现配!3.仪器

1)大型仪器:

高压灭菌锅,超净工作台,离心机,倒置显微镜,电融合仪。2)一般实验用品

大小培养皿,小烧杯,小滴管,刻度离心管,小漏斗,不锈钢网300目4.观察酶解效果5.原生质体的分离和纯化1)酶解后,用300目铜网过滤酶液,去除未酶解的杂质,将滤液收集在10ml离心管中。2)1000转/分离心3分钟,用吸管或移液枪弃上清(注意不要把收集的原生质体吸走)。3)用CaCl2.2H2O

(约1ml)悬浮下面的原生质体(PEG法);电融合法则用电融合液悬浮。4)显微镜观察提纯后的原生质体,若杂质较多可重复1)~3)操作。纯化的原生质体图示完整洋葱原生质体(40×)

完整烟草原生质体(40×)6.原生质体的密度测定用血细胞记数板记数。每一样品测定3次,根据测定结果,将悬浮原生质体密度调整至5*105个/ml。7.原生质体的融合(一)PEG法1)配制PEG液(5ml)

30%(w/v)PEG(MW=6000)1.5gCaCl2.2H2O0.0074gkH2PO40.0005

g

山梨醇0.0911g

调pH5.8~6.22)将两种原生质体悬液等量混合3)用刻度吸管将混合的原生质体悬液滴在直径为60mm的平皿中,每皿7~8滴,每滴约0.1ml。然后静置10分钟,使原生质体贴在皿底上,形成一薄层(应有3~5个平皿的重复)。4)用吸管将等量的PEG溶液缓慢地加在原生质体液滴上,再静置10~15分钟。此时可取一个平皿在倒置显微镜上观察原生质体间的粘连。PEG法原生质体的融合图示1、烟草叶肉和洋葱根尖细胞原生质体融合(40×)

2、烟草叶肉和洋葱根尖细胞原生质体的异源融合

(二)电融合法1)融合仪参数设置:成串电流频率0.5MHz,电压30V,成串时间1min,融合脉冲幅宽40μS,融合电压150v,融合槽间距1mm2)在融合小室中加入约100ul的原生质体悬浮液,将融合小室接好电极后至于倒置显微镜下,静置约3min,使悬浮的原生质体沉降到平板底部,同时打开成串脉冲输出开关及融合脉冲输出开关,使高压脉冲发生电路与融合小室接通。然后轻触脉冲触发开关,施加3次融合脉冲,每次间隔1s。融合脉冲后成串脉冲再保持1min。静置融合小室20~30min,在显微镜下观察融合过程。电融合法原生质体的融合结果原生质体成串(40×)原生质体融合(图1)电融合法原生质体的融合结果

原生质体融合(图2)

原生质体融合(图3)OverallaimsofresearchTo“capture”diseaseresistancefromwildpotatospeciesTousesegregatingpopulationstoidentifyplantdiseaseresistancegenesandtransferresistanceintopotatocultivarsSOMATICHYBRIDIZATIONINSOLANUMSomatichybridizationusingprotoplastfusionIsolateprotoplasts(typicallyleafmesophyll)fromtwoparentallinesFuseprotoplastseitherchemically(PEG)orusingelectrofusionCellmembranesfuseformingonecellcontaining2nucleiOncelldivisionnuclearmaterialcondensestogetherandhybridscellsareformedthatcontainDNAfrombothparentallines.

PotatoplantsgrowinginatesttubeFreshlyisolatedpotatoprotoplastsTwoprotoplastsreadytofusetogether

FusionproductsbegintodivideonnutrientmediumIftheconditionsareright,smallshootsemergefromthegreencalliPutativesomatichybridplants

Afertilesomatichybrid

Phenotypeofsomatichybridsclearlyshowscharacteristicsofbothparents

S.brevidenssomatichybridS.tuberosumPhenotypeofintraspecificdiploidsof

S.tuberosum

US-W9310.3SomatichybridUS-W9545.99SomatichybridshaveALLofthechromosomesfromeachparentplant

VerticilliumwiltresistancetestfieldatHancock,Wisconsin

LateblightresistanceinbackcrossplantderivedfromsomatichybridsbetweenS.bulbocastan

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