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文档简介

双向电泳的操作2007-7-4步骤样品制备（Samplepreparation）固相pH梯度胶条的水化（IPGstriprehydration）第一向等电聚焦（IEF）第一向胶条的平衡（IPGstripequilibration）第二向SDS电泳（SDS）检测染色（Detection/Staining）蛋白点的挖取，收集质谱分析总的策略一般性原则

尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失减少对蛋白质的人为修饰破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态样品制备需要的试剂

离液剂(chaotropes):

尿素（Urea）和硫脲（thiourea）表面活性剂（sufactants）也称去垢剂：

NP-40、TritonX-100等非离子去垢剂CHAPS与Zwittergent系列等双性离子去垢剂还原剂（reducingagents）二硫苏糖醇（DTT）二硫赤藓糖醇（DTE）磷酸三丁酯（TBP）选择性的加入

Tris-base蛋白酶抑制剂（如EDTA、Pefablocproteaseinhibitor、PMSForProteaseinhibitorcocktails）核酸酶常用裂解液UreaThioureaCHAPSDTTPharmalytepH3-10Tris-BasePefablocproteaseinhibitor1%SDS样品制备程序

培养细胞（culturecell）样品处理方法（1）培养细胞的收集；（2）用磷酸缓冲液（PBS）洗细胞3次（室温，1000g，各2min）；（3）将细胞分装到1.5mlEppendof管中，吸干残留的PBS；（4）加入裂解缓冲液（1.5x106个细胞大约加入100μL裂解液），在室温振荡1h，使其充分溶解；（5）4℃，40,000g，离心1h；（6）吸取上清并用Brandford法定量蛋白，然后分装至Eppendof管里保存在-78℃备用。组织样品处理方法

三氯醋酸－丙酮沉淀法（TCA/acetoneprecipitation）超速离心法BACK加样品水化加样品水化BACKIEF限流50uA200V1hr500V1hr1000V1hr8000V30mingradient8000V5hr(40000Vh)500V维持BACK第二向SDS电泳（SDS）BACK2-DE胶蛋白质点的检测

1）考马斯亮兰染色法；2)银染法；3）负染法；4）荧光染色法；5）放射性同位素标记法。考马斯亮兰染色法经典的考马斯亮兰染色（R-250）局限：灵敏度低（≈1μgprotein/spot）Neuhoff胶体考染法优点：背景低，灵敏度高，可达到200ngprotein/spot热考马斯亮兰染色及二次染色法.SYPRORuby

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