第二三章转基因食品生物技术详解演示文稿

第二三章转基因食品生物技术详解演示文稿现在是1页\一共有157页\编辑于星期四优选第二三章转基因食品生物技术现在是2页\一共有157页\编辑于星期四核酸核糖构成RNA戊糖 脱氧核糖构成DNA现在是3页\一共有157页\编辑于星期四

核酸

腺嘌呤(A)嘌呤鸟嘌呤(G)DNA、RNA均有嘧啶碱基胞嘧啶(C)胸腺嘧啶((T))尿嘧啶(U)DNA有RNA有每种核酸都含有四种碱基。现在是4页\一共有157页\编辑于星期四脱氧核苷酸

核酸

酯键核苷酸：

AMP,GMP,UMP,CMP脱氧核苷酸：

dAMP,dGMP,dTMP,dCMP现在是5页\一共有157页\编辑于星期四核酸-DNA核苷酸之间以3′,5′-磷酸二酯键连接形成多核苷酸链，即核酸。酯键（DNA的一级结构。现在是6页\一共有157页\编辑于星期四现在是7页\一共有157页\编辑于星期四现在是8页\一共有157页\编辑于星期四

核酸-DNADNA的二级结构—双螺旋结构。

DNA分子由两条反向平行的脱氧核糖 核苷酸链组成。氢键碱基位于内侧，戊糖和磷酸位于外侧碱基之间通过氢键进行互补配对，A=T，C≡G故A+G=T+C呈右手螺旋，碱基平面垂直于螺旋中心轴，螺旋一周包含10个碱基，螺距3.4nm。(B-DNA)现在是9页\一共有157页\编辑于星期四核酸-DNADNA的超螺旋结构超螺旋结构(superhelix或supercoil)DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。正超螺旋(positivesupercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方向相同负超螺旋

(negativesupercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方向相反现在是10页\一共有157页\编辑于星期四DNA主要携带两类遗传信息为RNA和蛋白质一级结构编码的信息调控信息现在是11页\一共有157页\编辑于星期四

染色体

真核生物染色体由DNA和蛋白质构成，其基本单位是核小体(nucleosome)。核心组蛋白八聚体核小体的组成DNA：

约200bp(碱基对)DNA组蛋白H1组蛋白：

H1 H2A，H2B H3，H4

核小体现在是12页\一共有157页\编辑于星期四基因DNA的基本功能是作为遗传信息的载体，为生物遗传信息的复制及转录提供模板。具有特定生物学功能的DNA片段称为基因（gene）。这些片段有的编码蛋白质，有的编码rRNA、tRNA，有的则是与复制、转录调控有关的DNA序列。一个生物体的全部DNA序列称为基因组（genome）。基因组的大小与生物的复杂性有关，如病毒SV40的基因组大小为5.1×103bp，大肠杆菌为5.7×106bp，人为3×109bp。现在是13页\一共有157页\编辑于星期四基因的结构特点结构基因在构成基因的特定DNA片段中，一段DNA序列贮存着一个特定RNA分子的序列信息，此段DNA的一级结构决定该RNA分子的一级结构。现在是14页\一共有157页\编辑于星期四结构基因非编码区编码区非编码区现在是15页\一共有157页\编辑于星期四结构基因的结构特点原核生物真核生物病毒结构连续断裂基因连续/断裂结构基因中贮存的遗传信息:RNA的结构信息;蛋白质的结构信息现在是16页\一共有157页\编辑于星期四基因重叠基因(overlappinggenes)核苷酸彼此重叠的两个基因称为重叠基因。现在是17页\一共有157页\编辑于星期四断裂基因一个基因由几个不相邻的编码序列组成，编码序列之间被非编码的序列隔开，这样的基因被称为断裂基因。外显子（Exon）：断裂基因中的编码部分，将包含在成熟的RNA中。内含子（Intron）：断裂基因中非编码部分，在初始转录物加工成成熟RNA时被除去。5‘UTR3‘UTREIEIE现在是18页\一共有157页\编辑于星期四基因假基因(pseudogene)假基因与正常基因有相似的序列，但是在编码序列中往往含有移码或终止密码，从而使其无法表达。现在是19页\一共有157页\编辑于星期四mRNA信使RNA携带蛋白质的序列信息，在翻译过程中作为模板指导蛋白质的合成。现在是20页\一共有157页\编辑于星期四原核生物物mRNA的特点多顺反子：几种不同的mRNA连在一起，相互之间由一段短的不编码蛋白质的间隔序列所隔开。这样的一条mRNA链含有指导合成几种蛋白质的信息。现在是21页\一共有157页\编辑于星期四真核生物物mRNA的特点条mRNARNA链单顺反子::一mRNA模板只含有一个翻译起始点和一个终止点，因而一个基因编码一条多肽链或或RNA。现在是22页\一共有157页\编辑于星期四原核生物mRNA5'PPP3'

蛋白质真核生物mRNA5'mG-PPP非翻译区

AAA3'

蛋白质核蛋白体结合位点起始密码子终止密码子编码序列现在是23页\一共有157页\编辑于星期四tRNA转运RNA在蛋白质生物合成中携带氨基酸进入核糖体，以mRNA为模板，合成蛋白质。现在是24页\一共有157页\编辑于星期四tRNA形状像三叶草，其一端是携带氨基酸的部位（CCA末端），另一端有3个碱基。这3个碱基可以与mRNA上的密码子互补配对，因而叫反密码子。在蛋白质合成过程中，携带特定氨基酸的tRNA凭借自身的反密码子识别mRNA上的密码子，吧所携带的氨基酸掺入到多肽链的一定位置上。反密码子中除常见的4种碱基外，还有次黄嘌呤（I）；共有61种反密码子。现在是25页\一共有157页\编辑于星期四rRNA核糖体RNArRNA与核糖体蛋白质共同构成核糖体，是蛋白质生物合成的场所。现在是26页\一共有157页\编辑于星期四核酶（（ribozyme）具有催化活力的RNA剪切、破坏特定的RNA分子现在是27页\一共有157页\编辑于星期四遗传密码mRNA密码子现在是28页\一共有157页\编辑于星期四密码子的特点遗传密码子是三联体密码：一个密码子由mRNA上相邻的三个碱基组成密码子具有通用性，不同生物密码子基本相同。密码子不重叠，在多核苷酸链上任何两个相邻的密码子不共用任何核苷酸。（与重叠基因不同）密码子具有简并性：除甲硫氨酸和色氨酸外，每一个氨基酸都至少有两个密码子。这样可以使氨基酸序列不会因为某一个碱基被意外替换导致氨基酸错误。密码子阅读和翻译具有一定方向性：从5’端到3’端。起始密码子：AUG（甲硫氨酸）；终止密码子：UAA、UAG、UGA。终止密码子没有相应的rRNA，只供释放因子识别来实现翻译的终止。现在是29页\一共有157页\编辑于星期四遗传密码决定蛋白质的一级结构结构基因遗传信息决定蛋白质的结构与功能蛋白质一级结构决定空间结构现在是30页\一共有157页\编辑于星期四

基因组（genome)：细胞或生物体所含的一套完整的单倍体遗传物质。核基因组线粒体基因组现在是31页\一共有157页\编辑于星期四病毒基因组病毒基因组结构和功能的特点：DNA1.不同病毒基因组大小相差较大2.不同病毒的基因组核酸本质不同

每种病毒只含有一种核酸：DNA病毒RNA病毒90%%3.基因组编码序列大于于90现在是32页\一共有157页\编辑于星期四4.单拷贝基因组（逆转录病毒基因组有2个拷贝）5.基因有连续和间断之分：病毒基因结构特征往往是与其宿主细胞的基因结构相类似。6.相关基因丛集7.基因重叠现在是33页\一共有157页\编辑于星期四链RNA股RNA与mRNA

病毒基因组核酸的主要类型双链链DNA：SV40病毒单链正股股DNA：M13噬菌体双链RNA：T4噬菌体单链负股股RNA：单链正股RNA：逆转录病毒 （＋）股：序列与mRNA相同与mRNA（－）股：序列与mRNA序列互补Back现在是34页\一共有157页\编辑于星期四原核生物基因组的结构和功能特点1.基因组相对较小，呈双链环状状DNA分子，无染色体结构，具有单个复制起始点。Ecoli基因组现在是35页\一共有157页\编辑于星期四2.具有操纵子（operon）结构：

几个功能相关的基因串连在一 起，由一个启动子控制，构成 一个转录单位，转录产生一个 多顺反子子mRNAmRNA。现在是36页\一共有157页\编辑于星期四3.其它结构特点：rRNA

－－基因密度高，多为单拷贝；编码的基因往往是多拷贝因(－－重复序列很少－－有编码同工酶的同基因(分枝酸别构 酶、乙酰乳酸合酶）－－不同原核生物物GC含量变化很大 （25%%-75%%）不等现在是37页\一共有157页\编辑于星期四质粒粒DNA(plasmid)的DNA细菌细胞内染色体以外的DNA序列。常2共价闭合环状，能自主复制通常2-3Kb现在是38页\一共有157页\编辑于星期四质粒粒DNA的分类功能：R质粒：抗药性质粒。F质粒：决定细菌的性别。Col质粒：使大肠杆菌能合成大肠杆菌素。拷贝数：严谨型（stringentplasmid)：低拷贝，一个细菌细胞内只含一个或者几个。松弛型(relaxedplasmid)：高拷贝，一个细菌细胞内含含1010－60个或者更多。现在是39页\一共有157页\编辑于星期四基因真核生物基因组（一）染色体DNA的组成1.单一序列2.中度重复序列3.高度重复序列现在是40页\一共有157页\编辑于星期四基因单一序列单一序列

只有一个拷贝,约占人类基因组的50％。结构基因主要存在于单一序列中。现在是41页\一共有157页\编辑于星期四

基因中度重复序列

中度重复序列拷贝数为102-105,约占人类基因组的35％。在基因表达及调控中起重要作用。

tRNA、rRNA基因 编码组蛋白、免疫球蛋白基因可能是基因调控相关序列Alu家族现在是42页\一共有157页\编辑于星期四基因高度重复序列高度重复序列拷贝数为106-108,一般不能转录，但参与染色体结构的维持、形成结构基因间隔等。卫星DNA：存在于非编码区的串联重复序列，在基因组中约占5％，如着丝粒、端粒等。反向重复序列：两个顺序列相同的拷贝在DNA链上呈反向排列。在基因组中约占5％，常见于基因调控区。现在是43页\一共有157页\编辑于星期四真核基因组结构特点一、结构庞大复杂，基因数目多二、由染色体DNA和线粒体DNA组成三、基因组绝大多数为非编码序列，到5总DNA50%

编码序列只有不到5％。其中含有大量的重复序列占总DNA50%现在是44页\一共有157页\编辑于星期四二、基因表达及其调控基因表达是DNA分子中蕴藏的遗传信息，通过转录、翻译形成蛋白质或转录形成RNA发挥功能的过程。转录翻译现在是45页\一共有157页\编辑于星期四转录前mRNAmRNA现在是46页\一共有157页\编辑于星期四翻译起始

：核糖体在mRNA上的组装延伸

：氨基酸的转运、肽链的形成及沿mRNA移位终止

：多肽链的释放现在是47页\一共有157页\编辑于星期四前导区TATA框

基因基因表达调控

基因的调控是指对基因的转录与翻译的调节机制。 基因表达调控在多层次

进行，表现出时空性

。

外显子：具有编码意义 转录单位 内含子：无编码意义

结构基因非编码区尾部区调控区启动子增强子终止子CAAT框GC框：调节转录活动

mRNA裂解信号 回文结构现在是48页\一共有157页\编辑于星期四转录的调控

基因基因表达调控

顺式作用元件

：能影响基因表达，但不编码RNA和蛋白质的DNA序列.包括启动子、增强子、终止子。

反式作用因子

：能识别和结合特定的顺 式作用元件,并影响基因转录的一类蛋白质 或RNA翻译的调控现在是49页\一共有157页\编辑于星期四基因基因表达调控1.转录前的调控2.转录水平的调控3.转录后的调控4.翻译水平的调控55.翻译后的调控现在是50页\一共有157页\编辑于星期四基因转录前的调控指基因被激活和抑制的机理。真核生物基因调控系统模型螺旋化程度低的常染色质可进行转录，螺旋化程度高的异染色质不转录。组蛋白抑制DNA的转录。组蛋白转位模型现在是51页\一共有157页\编辑于星期四基因转录水平的调控RNA聚合酶与启动子

的结合对转录的启动十分关键。增强子

能加强启动效应。终止子

控制着转录的有效终止。顺式作用原件启动子(promoter)是与RNA聚合酶特异性结合而使转录开始的特定DNA序列，但本身并不转录，属于基因上游对转录起调控作用的5’非编码区。增强子(enhancer)是一段能增强启动子转录效率的特定DNA序列，可以提高基因转录的效率。具有远距离调控、无方向性等特点。终止子(terminator)是转录过程中，给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。终止子分为两类：一类是本体转录终止子，其基因序列上有一段富含GC的反向重复序列，其后跟随一段富含AT的序列因而转录生成的mRNA中能形成发夹式结构，后续一连串U；另一类是ρ-依赖转录终止子（ρ-因子为蛋白辅因子），其终止转录的作用需要ρ因子的协同。终止子与启动子不同，启动子由DNA序列来提供信号，但真正起终止作用的不是DNA序列本身，而是转录生成的RNA。现在是52页\一共有157页\编辑于星期四遗传密码子（mRNA）起始密码子mRNA分子中编码多肽链第一个氨基酸的三联体碱基序列；大部分情况下为AUG。终止密码子mRNA分子中作为肽链合成终止信号的三联体碱基序列；大部分情况下为UAA、UAG和UGA，它们不编码氨基酸。现在是53页\一共有157页\编辑于星期四区别启动子和终止子均为结构基因非编码区的DNA序列，且长度远不止三个碱基，都与基因的转录过程相关联。起始密码子和终止密码子均位于mRNA中，且均只含有三个碱基，都与mRNA的翻译过程相关联。现在是54页\一共有157页\编辑于星期四基因转录后的调控变通性断裂基因的表达、核内异质RNA的加工效率及mRNA的稳定性决定了转录后过程的特点。现在是55页\一共有157页\编辑于星期四基因翻译水平的调控受核糖体的数量，mRNA的成熟度，起始因子(IF)，延长因子(EF)，释放因子(RF)以及各种酶的影响。现在是56页\一共有157页\编辑于星期四基因翻译后的调控翻译初产物需经加工、修饰才具有活性，翻译后的调控主要是指蛋白质的加工和修饰：①剪切②化学基团的修饰③酶原的激活现在是57页\一共有157页\编辑于星期四基因基因突变(genemutation)基因突变

是指基因的核苷酸序列发生改变，而造成基因表达产物的变化，从而引起表型的改变。生殖细胞突变发生在生殖细胞中的基因突变，可通过有性生殖遗传给后代，并存在于子代的每个细胞中。

体细胞突变

发生在体细胞中的基因突变，不会传递给子代，但可传递给由突变细胞分裂所形成的子细胞，在局部形成突变细胞群，它可能成为病变甚至癌变的基础。现在是58页\一共有157页\编辑于星期四基因基因突变的类型及分子机制1.碱基替换DNA分子中的一个碱基对被另一个碱基对所替代，也称为点突变(pointmutation)。转换(transition)指一种嘌呤被另一种嘌呤所替代或一种嘧啶被另一种嘧啶所替代。颠换(transversion)是嘌呤和嘧啶碱基之间的替代。现在是59页\一共有157页\编辑于星期四基因2.碱基的插入与缺失移码突变(frame-shiftmutation)某些化合物与DNA结合后，可使DNA分子插入或缺失一个或几个碱基对，使该碱基对以下的读码顺序发生移动，从而改变其遗传信息。现在是60页\一共有157页\编辑于星期四基因3.动态突变又称不稳定三核苷酸重复序列突变。基因的编码区或非编码区的三核苷酸重复序列，如(CAG)拷贝数变化，超过了正常范围。现在是61页\一共有157页\编辑于星期四基因基因突变的效应基因突变可造成蛋白质（包括酶蛋白）结构改变或活性降低，甚至缺乏，导致各种遗传性疾病的发生。（1）引起细胞中结构蛋白的改变分子病：基因突导致蛋白质数量或结构的异常而产生的疾病称为分子病。如镰刀状红细胞贫血症（2）引起遗传性代谢病遗传性代谢病（遗传性酶病）：基因突变导致酶蛋白结构或数量的异常而引起的疾病称为遗传性代谢病。如苯丙酮尿症、白化病等。现在是62页\一共有157页\编辑于星期四基因（3）与肿瘤形成密切相关目前认为与癌症发生直接相关的基因有原癌基因

(oncogene)及抑癌基因

(tumorsuppressorgenes)。基因突变一方面可使原癌基因激活另一方面可使抑癌基因缺失或失活，这两方面的变化都可导致细胞的恶性转化。现在是63页\一共有157页\编辑于星期四基因组学：研究生物系统的基因结构组成，即DNA的序列及其表达。转录组学：研究生物系统中所含mRNA的类型与拷贝数。蛋白组学：研究由生物系统表达的蛋白质及由外部刺激引起的差异。代谢组学：研究生物体系（细胞，组织或生物体）受外部刺激所产生的所有代谢产物的变化，是基因组学和蛋白组学的延伸。现在是64页\一共有157页\编辑于星期四转录组（transcriptome）转录组（transcriptome）：某一生理条件下，一个活细胞所能转录出来的所有RNA的总称，包括mRNA，rRNA，tRNA及非编码RNA；狭义上指所有mRNA。现在是65页\一共有157页\编辑于星期四转录组学(transcriptomics)

转录组学时一门在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控规律的学科，即从RNA水平研究基因表达的情况。现在是66页\一共有157页\编辑于星期四

转录组学（transcriptomics）基因表达：基因携带的遗传信息转变为可辨别的表型的整翻译

转录个过程：DNAmRNA蛋白质以DNA为模板合成RNA的转录过程是基因表达的第一步，也是基因表达调控的关键环节。与基因组不同的是，转录组的定义包含了时间和空间的限定。同一细胞在不同生长时期和生长环境下，其基因表达情况是不完全相同的。现在是67页\一共有157页\编辑于星期四转录组学（transcriptomics）人类基因组计划完成了对基因组的测序工作。人类基因组包含30亿个碱基对，其中大约只有5万个基因转录成mRNA，转录后的mRNA能被翻译生成蛋白质的也只占转录组的40%左右。同一组织表达几乎相同的一套基因以区别于其他组织，如：脑组织只表达全部基因中的30%左右而显示出组织的特异性。现在是68页\一共有157页\编辑于星期四蛋白质组（proteome）蛋白质组（proteome）：PROTEins+genOME，意思是Proteinsexpressedbyagenome（基因组表达的所有蛋白质），即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。现在是69页\一共有157页\编辑于星期四蛋白质组学(proteomics)

研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态，了解蛋白质组成员间的相互作用关系，了解蛋白质的结构与功能的关系，以及基因结构与蛋白质结构功能的关系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。现在是70页\一共有157页\编辑于星期四转录组学和蛋白组学的局限性：转录组学或蛋白组学上的变化不总能反映基因变更时在生化层面的表现型的改变。现代技术对于转录组学和蛋白组学中mRNA以及蛋白质

的识别是通过已知数据库进行序列比对的来实现的，因此识别和对比过程是间接

的。如果在缺乏某mRNA或蛋白质的数据信息时，以上的两种组学就只能为人们提供少量的信息。现在是71页\一共有157页\编辑于星期四代谢组和代谢组学代谢组(metabolome)：基因组的下游产物也是最终产物，是一个细胞、组织或器官中所有新陈代谢产物的集合,包含一系列不同化学型的分子,比如肽、碳水化合物、脂类、核酸以及异源物质的催化产物等。代谢组学(Metabonomics/Metabolomics)：通过考察生物体系（细胞、组织或生物体）受刺激或扰动后（如将某个特定的基因进行修饰），其代谢产物的变化，来研究生物体系的一门科学。现在是72页\一共有157页\编辑于星期四代谢组学(学(metabonomics)与转录组学和蛋白质组学比较，代谢组学专门研究生物体系受外部刺激后所产生的所有代谢产物的变化，能够更准确地反映生物体系的状态，且位于系统生物学的最下游，是生物体系整体功能或状态最终结果的表现。因此有人认为，“基因组学和蛋白质组学告诉你什么可能会发生，而代谢组学则告诉你什么确实发生了。

”（BillLasley,UCDavis）现在是73页\一共有157页\编辑于星期四代谢组学(学(metabonomics)代谢组学研究的目的是定量分析一个生物系统内所有代谢物的含量。代谢组学分析可以指示细胞、组织或器官的生化状态,协助阐释新基因或未知功能基因的功能,并且可以揭示生物各代谢网络间的关联性,帮助人们更系统地认识生物体。现在是74页\一共有157页\编辑于星期四代谢组学的优点：1）基因和蛋白表达的有效的微小变化会在代谢物上得到放大，从而使检测更容易；2）代谢组学的技术不需建立全基因组测序及大量表达序列标签（EST）的数据库；3）代谢物的种类要远小

于基因和蛋白的数目，每 个生物体中代谢产物大约在103数量级，细菌基 因组中几千个基因；4）因为代谢产物在各个生物体系中都是类似的，所以代谢组学研究中采用的技术更通用；现在是75页\一共有157页\编辑于星期四基因工程也称基因拼接技术或DNA重组技术一、基因工程的定义 按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，

供体生物目的基因加以修饰改造，

剪切和拼接，建构重组DNA分子然后放到另一种生物的细胞里，

受体细胞定向地改造生物的遗传性状。现在是76页\一共有157页\编辑于星期四二、基因工程的理论依据

DNA是绝大多数生物的遗传物质，不同生物的

DNA的基本单位和结构相同 中心法则：DNARNA蛋白质翻译复制

转录逆转录复制基因是遗传物质结构和功能的基本单位各种生物共用一套遗传密码现在是77页\一共有157页\编辑于星期四三、DNA重组技术的基本工具1、限制性核酸内切酶——分子手术刀来源：主要从原核生物中分离提纯特点：高度的专一性多样性识别并切割特定的某种核苷酸序列已经分离出4000种现在是78页\一共有157页\编辑于星期四作用：粘性末端连接连接效率高

相同酶切末端平端连接连接效率低识别双链DNA分子上某种特定的核苷酸序列，

含有4～8个核苷酸

中心轴线两侧的碱基反向对称重复排列

并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的 磷酸二酯键断开 平切：如SmaⅠ酶，沿中轴线处切开， 形成平末端，连接效率低

错位切：如EcoRⅠ酶，从中轴线两侧切开， 形成黏性末端，连接效率高现在是79页\一共有157页\编辑于星期四2、DNA连接酶——“分子缝合针” 将双链DNA分子的两个片段连接起来——通过形成磷酸二酯键E.coliDNA连接酶：连接黏性末端T4DNA连接酶：连接黏性末端或平末端DNA连接酶与DNA聚合酶功能的区别：DNA连接酶催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键而连接起来DNA聚合酶催化游离的脱氧核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键而连接起来现在是80页\一共有157页\编辑于星期四3、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”作用：将目的基因（外源基因）送入受体细胞条件：有一个或多个限制酶切割位点在受体细胞中能自我复制，或者能整合到染色体DNA上，随染色体DNA同步复制带有标记基因，便于甄别和筛选安全，对受体细胞无害大小合适，方便操作种类：质粒（经人工改造，常用）、λ噬菌体衍生物、动植物病毒、农杆菌等现在是81页\一共有157页\编辑于星期四核酸包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）;

脱氧核糖核酸（DNA）包括线状基因组DNA和环状

DNA（质粒DNA）。现在是82页\一共有157页\编辑于星期四

质粒DNA

质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。 质粒具有自主复制和转录能力，能在子基因组DNA质粒DNA代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。现在是83页\一共有157页\编辑于星期四四、基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取⑴从基因组文库中获取目的基因将某生物的基因组进行切割，获得一批长度为15—20kb的DNA片段限制酶将上述DNA片段分别与运载体结合，再分别导入受体菌群体的各细胞中储存、复制——构建成该生物的基因组文库需要时通过一定方法从基因组文库中获取目的基因现在是84页\一共有157页\编辑于星期四⑵利用反转录法获取目的基因 提取某生物细胞中的mRNA

反转录酶

RNA—DNA杂交分子

RNA酶降解RNA链

单链DNA（cDNA）

DNA聚合酶

双链DNA

导入受体菌细胞中储存、复制，建构cDNA文库PCR技术扩增

一定方法获取目的基因现在是85页\一共有157页\编辑于星期四⑶直接提取后利用PCR技术扩增而获取目的基因以探针从生物细胞中提取目的基因碱基序列已知利用PCR技术扩增目的基因⑷人工合成目的基因测定某蛋白质中氨基酸的排列顺序利用密码子表推测mRNA中碱基排列顺序利用碱基互补配对原则推测DNA反义链的碱基排列顺序化学合成DNA合成仪合成双链DNA（目的基因）现在是86页\一共有157页\编辑于星期四真核生物的基因结构非编码区非编码区编码区外显子内含子启动子终止子

转录初级mRNA

加工 成熟mRNA

翻译 蛋白质现在是87页\一共有157页\编辑于星期四PCR技术(polymerasechainreaction)中文名称：聚合酶链式反应1、PCR原理：

变性温度下，DNA双链变性双螺旋解开成单链DNA，在退火温度中人工合成的特异引物根据碱基互补配对原则与单链DNAA特异结合，然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸温度下不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则在引物的引导下合成与模板DNA互补的新链，实现DNA的扩增。现在是88页\一共有157页\编辑于星期四

PCR技术

原理：DNA的半保留复制反应系统： 微量DNA样品——模板

DNA聚合酶（Tag聚合酶，具有热稳定性）4种游离的脱氧核糖核苷酸（过量）

——dAMP、dTMP、dGMP、dCMP引物——人工合成的含有20个碱基的核苷酸序列（过量）现在是89页\一共有157页\编辑于星期四反应过程 样本DNADNA聚合酶引物提高温度（90～95℃）,DNA变性 退火（55～60℃）,与引物互补

循环 进行DNA数量呈指数方式增加

在适宜温度下（70～75℃）形 成DNA新链现在是90页\一共有157页\编辑于星期四2、PCR反应过程：变性：DNA双链变为单链；退火：引物与模板结合；延伸：合成互补链；上述过程通过PCR仪的程序设计及自动运作完成。现在是91页\一共有157页\编辑于星期四PCR技术与体内DNA复制的区别：1.PCR不需要DNA解旋酶；体内DNA复制需要；

2.PCR需要耐热的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性；

33.PCR一般可以经历三十多次循环，短时间内形成大量DNA片段；而生物体内DNA复制需要生物体自身的复制，形成整个DNA分子。现在是92页\一共有157页\编辑于星期四

（1）特异PCR

扩增所用的引物是特异的，扩出的产物也是特定的。FR（2）反转录PCR（RT-PCR） 是一类以mRNA为最初模板的基因的扩增。5`CAPAAAAAAAAAATTTTTTTTTTT现在是93页\一共有157页\编辑于星期四（3）反向PCR： 根据已知序列扩增两侧序列的方法。未知序列酶切酶切引物1引物2

已知序列未知序列此PCR操作过程： 酶切基因组DNA

连接环化目的DNA

用引物1和引物2组合扩增出侧翼序列现在是94页\一共有157页\编辑于星期四电泳目的：对核酸分子进行分离和检测影响电泳迁移率的因素分子的大小：小则快带电荷数：多则快（不同DNA分子片段电荷大致相等）不同的DNA片段的电泳迁移率主要取决于分子的大小!现在是95页\一共有157页\编辑于星期四凝胶浓度:

浓度大，筛孔小，适合小分子电泳； 浓度小

，筛孔大，适合大分子电泳

♦凝胶分辨DNA的能力：琼脂糖聚丙烯酰胺凝胶浓度分辨范围(kb)浓度分辨范围(bbp)0.3%5-600.6%1-200.7%0.8-100.9%0.5-71.2%0.4-63.51000-2000 590-50082001525-1601.5%0.2-3206-100原来如 此！凝胶浓度的选择：取决于待检测的DNA的大小现在是96页\一共有157页\编辑于星期四2、基因表达载体的构建使目的基因稳定存在并遗传一个基因表达载体包括：（最核心步骤）使目的基因表达和发挥作用启动子——RNA聚合酶的识别和结合位点，驱动基因转录目的基因——使受体生物表现出更符合人类需求的性状终止子——结束转录标记基因——鉴别筛选出含目的基因的受体细胞其他如复制原点、运载体上原有的基因现在是97页\一共有157页\编辑于星期四DNA重组技术基本步骤•1.分离获得目的基因；

2.在体外进行DNA重组，将外源DNA连接到能自我复制又带有选择标记的载体上；3.将重组DNA转移入受体细胞；44.筛选出含有目的DNA的受体细胞克隆；现在是98页\一共有157页\编辑于星期四目的基因制备和载体系统

目的基因来源：基因组DNA分离、化学合成、PCR扩增、cDNA文库及DNA文库中制得。载体：质粒、λ噬菌体、柯氏质粒、YAC载体等工具酶：限制性内切酶、连接酶、DNA聚合酶等现在是99页\一共有157页\编辑于星期四一、DNA重组技术相关概念克隆(clone)来自于同一始祖的一群相同分子、细菌、细胞或动物（常被成为副本或拷贝）。克隆化(cloning)获取大量单一拷贝的过程，也称无性繁殖。现在是100页\一共有157页\编辑于星期四DNA克隆(DNAcloning)

应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子。继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞。

再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，又称基因克隆(genecloning)或分子克隆(molecularcloing)。现在是101页\一共有157页\编辑于星期四

“克隆”某一基因或DNA片段过程中，将外源DNA插入载体分子所形成的复制子是杂合分子－嵌合DNA，所以DNA克隆又称重组DNA(recombinantDNA)。

实现DNA克隆所用的方法及相关的工作称DNA重组技术(recombinantDNAtechnology)，又称基因工程(geneticengineering)。现在是102页\一共有157页\编辑于星期四二、DNA重组技术基本程序外源DNA的获取克隆载体的选择与构建目的基因与载体的连接DNA导入受体菌重组体的筛选克隆基因的表达现在是103页\一共有157页\编辑于星期四三、DNA重组的基本步骤+

连接载体目的基因

+

转化、筛选和鉴定阳性克隆

克隆基因表达

含重组子的阳性克隆分、切、接、转、筛现在是104页\一共有157页\编辑于星期四目的基因的载体连接--接，重组DNA技术核心现在是105页\一共有157页\编辑于星期四

二、外源DNA片段和载体的连接（一）粘性末端连接法适用于插入片段和质粒载体具有相同的粘 性末端单酶

目的基因

用同一种限制性内切酶酶切酶切

DNA连接酶重组质粒

缺陷

高背景(自身环化)双向(正、反)插入 多拷贝插入现在是106页\一共有157页\编辑于星期四（二）平头末端连接法

质粒

产生平末端的

内切酶

核酸酶S1

目的基因

DNA连接酶

本法适用于在质粒 和目的基因上没有相同的酶切位点！重组质粒现在是107页\一共有157页\编辑于星期四（三）人工接头法目的基因++接头(linker)质粒

DNA连接酶

用同一种限制性内切酶酶切

DNA连接酶

本法适用于在质粒和 目的基因上没有相同的重组质粒酶切位点现在是108页\一共有157页\编辑于星期四（四）同聚物接尾法

质粒

内切酶末端转移酶

+dGTP

目的基因末端转移酶

+dCTPDNA连接酶重组质粒

本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点连接反应：16℃，16h如何实现？现在是109页\一共有157页\编辑于星期四

三、重组DNA分子导入受体细胞----转宿主细胞：被导入重组分子的细胞

原核细胞：大肠杆菌、链霉菌宿主细胞及枯草杆菌真核细胞：酵母、昆虫细胞及哺乳动物细胞现在是110页\一共有157页\编辑于星期四大肠杆菌的转化转化原意：细菌细胞的生物学特性由于受纳了外源DNA而发生可遗传的改变。转化(transformation)质粒DNA或以质粒为载体构建的重组DNA导入细菌的过程转化的关键：感受态细菌的制备现在是111页\一共有157页\编辑于星期四大肠杆菌2DNA化学转化法感受态细胞----competentcell

用理化方法人工诱导细胞，使 之处于易于吸收和容纳外源DNA

分子的状态，此时的细菌称～。

转化原理及转化、转染程序

CaCl0～4℃膨胀成球形

附着细胞表面原理

42℃

90s

热休克细胞吸收抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物

复苏

分裂增殖现在是112页\一共有157页\编辑于星期四细胞电击：重组质粒的导入方法P

化学法：需感受态细 胞转化程序法：不需感受态

对数生长CaCl

感受态细菌(4℃保存24h)

期的细菌02～4℃重组质粒DNA+细菌

4℃热休克30min(42℃,90s)普通培养基温育涂布于含抗生素37℃的培养基平板倒置培养单菌落现在是113页\一共有157页\编辑于星期四（一）抗生素平板筛选----实为插入失活法Kanr

KansAmpr

Ampps

Tetr

Tets非转化子阳性重组子自身环化载体未酶解完全载体非目的基因插入载体单抗生素筛选 转化子

仅作为初步筛选现在是114页\一共有157页\编辑于星期四(二）酶切电泳鉴定快速小量提取质粒DNA琼脂糖凝胶电泳跑得慢--重组质粒跑得快--空载体现在是115页\一共有157页\编辑于星期四分离基因

克隆到某中间载体 转化大肠杆菌 提取质粒 限制酶切/连接克隆到植物表达载体

pKS,pBR332,pGEM-TJM109,TOP10…HindIII/EcroI…T4ligase pBI121,pCAM1001…基因枪转化

转化农杆菌LBA4404,EHA现在是116页\一共有157页\编辑于星期四裸子植物

3、将目的基因导入受体细胞（1）将目的基因导入植物细胞常用

农杆菌转化法农杆菌提取

Ti质粒目的基因

构建表达载体转入感染双子叶植物 农杆菌目的基因整合目的基因插入受体细胞染色体DNA目的基因随染色体DNA复制并表达现在是117页\一共有157页\编辑于星期四基因枪法（适用于单子叶植物）目的基因

花粉管法 柱头子房壁 胚珠简便经济

萌发的花粉粒 花粉管 精核 卵细胞 极核现在是118页\一共有157页\编辑于星期四（2）将目的基因导入动物细胞——显微注射技术提纯表达载体

显微注射仪注射受体动物受精卵移植雌性动物输卵管或子宫内发育具有新性状的动物（转基因动物）现在是119页\一共有157页\编辑于星期四（3）将目的基因导入微生物细胞 表达载体DNACa2+处理常态细菌感受态细胞

混合

被转化的细菌细菌吸收（含目的基因）现在是120页\一共有157页\编辑于星期四4、目的基因的检测与鉴定检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因——分子杂交技术以被标记的目的基因作探针，与转基因生物基因组DNA杂交，观察是否出现杂交带以被标记的目的基因作探针，检测目的基因是否转录出mRNA——分子杂交技术与转基因生物提取出的mRNA杂交，观察是否出现杂交带现在是121页\一共有157页\编辑于星期四检测目的基因是否翻译成蛋白质

——抗原—抗体杂交技术 目的基因表达的蛋白质（抗原）

刺激

产生相应抗体从转基因生物体内提取蛋白质抗原—抗体杂交

观察是否出现杂交带检测转基因生物的性状 观察或测定是否出现目的基因所决定的性状

抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等现在是122页\一共有157页\编辑于星期四第三章转基因技术在食品生产和加工中应用1、生产转基因食品利用转基因技术得到的新型生物叫转基因生物，又叫遗传饰变生物（geneticallymodifiedorganism，GMO），即用遗传工程的方法将一种生物的基因转入到另一生物体内，从而是接受外来基因的生物获得它本身所不具有的新特性。

含有转基因生物成分或者利用转基因生物（植物、动物、微生物）生产加工的食品，称为转基因食品（GMF），包括食品原料及食品添加剂。现在是123页\一共有157页\编辑于星期四1983年世界首次报道转基因烟草和马铃薯。1989年首例转基因工程菌生产的凝乳酶获批在奶酪工业中应用（瑞士），1994年首批转基因植物获准进行商品化生产（美国），如延熟番茄，抗除草剂棉花等。 转基因作物主要是大豆、玉米、棉花、油菜，其次是西红柿、马铃薯、甜椒、烟草、南瓜等。主要种植国：美国、阿根廷、加拿大和中国。现在是124页\一共有157页\编辑于星期四转基因作物优点： ①解决食物短缺。 ②增加食品品种。 ③改进营养成分。④增强作物抗病虫害、抗逆性能。⑤延长食品货架期等。现在是125页\一共有157页\编辑于星期四2、改造食品微生物（1）改良微生物菌种。如面包酵母转入有关酶基因后，其麦芽糖透性酶和麦芽糖酶含量大大提高，生产出面包CO2多，膨发性好，松软可口。将大麦中α-淀粉酶转入啤酒酵母，这种酵母可直接利用淀粉进行发酵生产啤酒。（2）生产酶制剂。如凝乳酶的生产，把小牛胃的凝乳酶基因转移到细菌或真核生物中，再培养生产出凝乳酶。1990年美国FDA已批准在干酪生产中使用这种凝乳酶。现在是126页\一共有157页\编辑于星期四3、改善食品原料的品质改良动物、植物食品原料品质，改善园艺产品采后品质。4、改进食品生产工艺5、生产食品添加剂（如氨基酸）和功能性食品现在是127页\一共有157页\编辑于星期四一、转基因技术对生态环境可能造成的影响1、基因转移问题。

植物间传粉也可能将基因转移给环境中的野生近缘种，也可能将基因转移给同一物种的其它植物。2、杂草化问题。

转基因植物本身可能演化为杂草。可能将一些抗病虫害基因、抗逆基因转移给野生近缘种或杂草，产生“超级杂草”。现在是128页\一共有157页\编辑于星期四3、生物多样性问题。

转基因植物的新性状不仅对目标生物种群大小、进化速度产生直接影响，也可对非目标生物产生直接或间接影响。4、抗病毒转基因问题。转入的病毒基因可能与侵染该植物的其它病毒进行重组，产生出新的病毒。5、毒性和过敏问题。

大多数转基因生物作为人类的食品或动物饲料，如转入的外源基因增加了受体作物的毒性或其产物是人类的过敏源，那将引起中毒和过敏的可能性。现在是129页\一共有157页\编辑于星期四1、转基因食品外源基因的食用安全性外源基因含两大类：①目的基因：人们期望宿主生物获得的某一或某些性状的遗传信息载体。

②标记基因：在遗传转化过程中，筛选和鉴定转化细胞、组织时，需要一些起帮助作用的基因，这类外源基因叫标记基因。有时标记基因本身也就是目的基因，如除草剂抗性基因。现在是130页\一共有157页\编辑于星期四选择标记基因：如抗生素抗性基因，除草剂抗性基因等。报告基因：如黄类素酶、氯霉素乙酰转移酶，绿色荧光蛋白酶等。转基因食品外源基因食用安全性：①有无直接毒性；②是否会水平转移。（1）有无直接毒性①目前转基因食品所用外源基其组成与普通DNA并无差异；②转基因食品中外源基因的含量很少。目前未发现外源基因的食用有直接毒性。现在是131页\一共有157页\编辑于星期四2、未预料的基因多效性（genepolypheny）

由于外来基因的插入，宿主原遗传信息被打乱，可能发生一些意外效应。但目前尚无这方面的报道。（1）位置效应。外源基因插入位置，宿主某些基因可能被破坏，可能诱发某些沉默基因（silentgene）的表达。（2）干扰代谢作用。插入基因的产物可能与宿主代谢途径中的一些酶相互作用，干扰代谢途径，使某些代谢物在宿主体内积累或消失。（3）改变食品营养品质。增加或降低。（4）潜在毒性。外源基因可能提高天然植物毒素基因的表达，如土豆茄碱、豆类蛋白酶抑制剂基因等现在是132页\一共有157页\编辑于星期四3、转基因食品中外源基因编码蛋白的安全性外源基因编码蛋白有无直接毒性、过敏性和抗药性。（1）外源基因编码蛋白有无直接毒性。

①据外源基因编码蛋白的化学组成，将其与已知毒性蛋白的化学组成进行同源性比较，判断其毒性。 ②采用动物实验方法，评判外源基因编码蛋白的毒性情况。现在是133页\一共有157页\编辑于星期四（2）外源基因编码蛋白有无过敏性。过敏蛋白特点：①具有T细胞和B细胞的识别区。②可产生专一的免疫球蛋白（IgE）抗体。从以下几方面判断外源基因编码蛋白有无过敏性：①外源基因是否编码过敏蛋白。②两类蛋白（外源基因编码蛋白、过敏蛋白）的氨基酸序列是否有免疫学上的明显内源性。 ③外源基因编码蛋白属某类蛋白成员，此类蛋白家庭的某些成员是否过敏蛋白。现在是134页\一共有157页\编辑于星期四（3）外源基因编码蛋白有无抗药性。

目前转基因植物食品中常用的标记基因是抗生素抗性基因，因此食用这些含抗生素抗性基因的转基因食品是否会产生抗药性是转基因食品安全性评价的又一方面。现在是135页\一共有157页\编辑于星期四三、转基因食品的检测技术转基因食品检测工作中所涉及的检测目标包括三种类型：DNA、RNA和蛋白质。对于蛋白质的检测主要用血清学方法，对于DNA和RNA的检测主要采用PCR及核酸杂交的方法。现在是136页\一共有157页\编辑于星期四第三节转基因食品的安全性评价和法规管理一、转基因食品的安全性评价安全性评价是安全管理的核心和基础之一。1、转基因食品安全性评价目的

①保障人类健康和环境安全。 ②回答公众疑问。 ③促进国际贸易，维护国家权益。 ④促进生物技术的可持续发展。 ⑤提供科学决策的依据。现在是137页\一共有157页\编辑于星期四2、转基因食品安全性评价的原则（1）实质等同性（substantialequivalence）原则（2）预先防范（precaution）原则（3）个案评估（casebycase）原则（4）逐步评估（stepbystep）原则实验室研究——中间试验——环境释放——生产性试验——商业化生产（5）风险效益平衡（balanceofbenefitsandrisks）原则（6）熟悉性（familiarity）原则现在是138页\一共有157页\编辑于星期四3、转基因食品安全性评价内容①遗传工程体的特性分析，②实质等同性分析。（1）遗传工程体（GMO）的特性分析。这有助于判断某种新食品与已有食品是否有显著差异。 ①供体：来源、分类、学名、食用历史、关键营养成分、是否有毒性史、过敏性、传染性、抗营养因子、生理活性物质、与其它物种关系等。②被修饰基因及插入的外源DNA：来源、结构、功能、用途、转移方法、介导物的名称、来源、特性及安全性。③受体：与供体相比的表型特性和稳定性、外源基因拷贝量、引入基因的功能与特性、引入基因移动的可能性等。现在是139页\一共有157页\编辑于星期四

（2）实质等同性分析

1993年经济合作发展组织（OCED）在绿皮书《现代生物技术食品的安全性评价：概念与原则》中，提出对现代生物技术食品采用实质等同性（substantialequivalence）的评价原则。 实质等同性比较内容：①生物学特性比较：②主要营养成分比较：③天然有毒物质比较：④抗营养因子比较：⑤过敏原比较：现在是140页\一共有157页\编辑于星期四实质等同原则（Substantialequivalence）1993年经济合作发展组织提出的。通过检测证明转基因作物加工的食品及食品成分与目前市场上销售食品的成分相同，则原则认为它们没有差异，无需进一步检测。如果个别成分不同，则只需要对这些个别成分进行单独的安全性检测。现在是141页\一共有157页\编辑于星期四实质等同原则的5项具体原则1)如两者本质是相同的，用传统的安全性评价程序对转基因食品评价。2)如在一定范围内有差别，用集中于对产生差别的因子进行评价。3)如果氨基酸序列与已知蛋白毒素的氨基酸序列是同系物，则要进行毒理学实验。4)如有蛋白质产生了抗营养作用，或营养成分发生改变，则要进行营养学评价。5)如两者完全不同或没可比的传统食品，则要特别设计动物模型试验证明其无毒后，须进行人体营养学试验。现在是142页\一共有157页\编辑于星期四①生物学特性比较：比较形态、生长、产量、抗病性、繁殖性、生理特性等。②主要营养成分比较：比较蛋白质、脂肪、碳水化合物、矿物质、维生素等。③天然有毒物质比较：如番茄中的α-番茄素，马铃薯中茄碱，葫芦科作物的葫芦素等。

④抗营养因子比较：抗营养因子是指能够影响人对食品中营养物质的吸收和对食物消化的物质，如豆科作物的蛋白酶抑制剂、脂肪氧化酶及植酸等。⑤过敏原比较：过敏原（allergen）是指能够造成某些人群食用后产生过敏反应的物质。过敏蛋白质在加工过程及消化过程中不易被降解，不易被糖基化现在是143页\一共有157页\编辑于星期四

应用实质等同性原则评价转基因食品时，应根据