第7章高效液相色谱法

第17章高效液相色谱法

(HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC)张松1现在是1页\一共有56页\编辑于星期四1.基本概念与特点2.HPLC与经典LC、GC的比较3.HPLC仪器结构4.液相色谱的固定相与流动相5.HPLC应用本章主要内容

现在是2页\一共有56页\编辑于星期四一、概述它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点．为了更好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面进行比较：3现在是3页\一共有56页\编辑于星期四

1．高效液相色谱法与经典液相色谱法高效液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化．为了获得高柱效而使用了粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。4现在是4页\一共有56页\编辑于星期四

1．高效液相色谱法与经典液相色谱法经典液相色谱高效液相色谱常压或减压高压，40～50MPa填料颗粒大填料颗粒小，2～50μm柱效低柱效高,40000～60000块/m分析速度慢分析速度快色谱柱只用一次色谱柱可重复多次使用不能在线检测能在线检测5现在是5页\一共有56页\编辑于星期四

（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20％．对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析．

2．高效液相色谱法与气相色谱法6现在是6页\一共有56页\编辑于星期四

(2)气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有相互作用力，仅起运载作用．而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的选择竞争．因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便．7现在是7页\一共有56页\编辑于星期四

(3)气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作．总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展．8现在是8页\一共有56页\编辑于星期四

2．高效液相色谱法与气相色谱法气相色谱高效液相色谱只能分析挥发性物质，只能分析20%的化合物几乎可以分析各种物质不能分析热不稳定物质可以分析热不稳定物质用毛细管色谱可得到很高的柱效色谱柱不能很长，柱效不会很高有很灵敏的检测器如ECD和较灵敏的通用检测器(FID和TCD)没有较高灵敏的通用检测器流动相为气体，无毒，易于处理流动相有毒，费用较高运行和操作容易运行和操作比GC难一些仪器制造难度较小仪器制造难度大9现在是9页\一共有56页\编辑于星期四液相色谱仪器

highperformanceliquidchromatograph10现在是10页\一共有56页\编辑于星期四液相色谱仪（2）11现在是11页\一共有56页\编辑于星期四液相色谱仪（3）12现在是12页\一共有56页\编辑于星期四液相色谱仪（4）13现在是13页\一共有56页\编辑于星期四二、高效液相色谱仪

高效液相色谱仪的结构示意见下图，一般可分为4个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统．此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等．14现在是14页\一共有56页\编辑于星期四高效液相色谱结构及流程图输液泵进样器色谱柱柱温箱检测器溶剂数据处理废液现在是15页\一共有56页\编辑于星期四1．高压输液系统由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统．它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件．常用的输液泵为机械往复式恒流泵．16现在是16页\一共有56页\编辑于星期四泵工作示意图凸轮柱塞杆柱塞密封圈单向阀泵头流动相入口流动相出口现在是17页\一共有56页\编辑于星期四2.进样系统

高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出．柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽.进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严．进样方式：注射器

18现在是18页\一共有56页\编辑于星期四阀

旋转式六通阀4/8/2023现在是19页\一共有56页\编辑于星期四旋转式六通阀工作原理20现在是20页\一共有56页\编辑于星期四3.分离系统——色谱柱

色谱柱是液相色谱仪的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属．玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备往内径较大，可达25mm以上。21现在是21页\一共有56页\编辑于星期四4.检测系统在液相色谱中，有两种基本类型的检测器.一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等.另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等.现将常用的检测器介绍如下:

22现在是22页\一共有56页\编辑于星期四1.紫外-可见光检测器⑴检测原理：基于Lambert-Beer定律，即被测组分对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组分浓度成正比。液相色谱仪一般都配置有UV-Vis检测器.⑵组成：光源、流通池、检测元件、工作站等。⑶特点：①灵敏度高，噪声低；②不破坏样品，可用于制备；③对温度、流动相流速波动不敏感，可用于梯度淋洗；④属于浓度型检测器。现在是23页\一共有56页\编辑于星期四⑷缺点①只能检测有紫外吸收的样品；②检测波长＞流动相的截止波长。⑸波长选择①选择λmax作检测波长，以得到较高的灵敏度；②检测波长＞流动相的截止波长。⑹紫外检测器的类型①固定波长型(已淘汰)；②可变波长型(最常用)；③二极管阵列检测器(最新型)。现在是24页\一共有56页\编辑于星期四（2）荧光检测器

（fluorescencedetector）

高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；其结构同荧光分光光度计。25现在是25页\一共有56页\编辑于星期四(3)示差折光检测器

（differentialrefractiveindexdetector）除紫外检测器之外应用最多的检测器；原理：折射率随介质中的成分变化而变化，连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值，差值与浓度呈正比；通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；对温度敏感、不能用于梯度洗脱。26现在是26页\一共有56页\编辑于星期四4/8/2023现在是27页\一共有56页\编辑于星期四三.液相色谱的固定相与流动相1.液相色谱固定相

高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以SiO2为基质，可承受7.O×108～1.O×109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在SiO2表面键合各种官能团，就是键合固定相，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5×108Pa。现在是28页\一共有56页\编辑于星期四高效液相色谱固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型两大类。表面多孔型：基体是30～40μm实心玻璃微球，表面附着一层厚度为1～2μm的多孔活性材料，如硅胶、氧化铝等。表面积小，柱容量低。

全多孔型：由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；现采用5～10μm的小颗粒，比表面积和柱容量都很大，是化学键合制备柱填料。29现在是29页\一共有56页\编辑于星期四化学键合固定相

化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；

a.硅氧碳键型：≡Si—O—Cb.硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si—

C

稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；

c.硅碳键型：≡Si—Cd.硅氮键型：≡Si—N现在是30页\一共有56页\编辑于星期四化学键合固定相的特点1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；3）耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；5）有利于梯度洗脱；现在是31页\一共有56页\编辑于星期四2.液相色谱的流动相

(1)流动相特性

（a）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（b）亲水性固定相常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液相色谱法，极性柱也称正相柱。（c）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液相色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。现在是32页\一共有56页\编辑于星期四(2)流动相类别按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。现在是33页\一共有56页\编辑于星期四(3)流动相选择在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六环>四氢呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>异丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)现在是34页\一共有56页\编辑于星期四(4)选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。现在是35页\一共有56页\编辑于星期四流动相应具备的条件:理想的流动相应具备化学稳定性好；对样品有较宽的溶解范围；扩散性好即低粘度；沸点适中；与检测方法具有好的兼容性；不损坏固定相和仪器；易于获得纯品并且毒性低。4/8/2023现在是36页\一共有56页\编辑于星期四四.高效液相色谱法的主要类型离子交换色谱尺寸排阻色谱（凝胶过滤色谱）亲和色谱分配色谱吸附色谱（如反相色谱，疏水作用色谱）现在是37页\一共有56页\编辑于星期四1.

液-液分配色谱

基本原理：组分在固定相和流动相上的分配系数不同；固定相：早期涂渍固定液，由于流失，已较少采用；现在应用最广的是化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到担体（硅胶）表面的游离羟基上。流动相：流动相与固定相均为液体，但应互不相溶。38现在是38页\一共有56页\编辑于星期四

根据两相极性程度，分为正相色谱和反相色谱：

正相色谱：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性。流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。

反相色谱：相反，流动相的极性大于固定液的极性。反相与正相的出峰顺序恰好相反。

39现在是39页\一共有56页\编辑于星期四2.液-固吸附色谱

固定相：为固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是硅胶。

流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与脱附。40现在是40页\一共有56页\编辑于星期四3.离子交换色谱

固定相：阴离子或阳离子交换树脂；流动相：阴离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；

基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；

阳离子交换：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

阴离子交换：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-

应用：离子及可离解的化合物，包括氨基酸、核酸等。41现在是41页\一共有56页\编辑于星期四42现在是42页\一共有56页\编辑于星期四5.尺寸排阻色谱（凝胶色谱）

固定相：凝胶具有一定大小孔隙分布。

原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。

可对相对分子质量在100-105范围内的化合物进行分离43现在是43页\一共有56页\编辑于星期四五.液相色谱分离类型的选择1.根据相对分子质量选择相对分子质量十分低的样品，其挥发性好，适用于气相色谱．标准液相色谱类型（液--固、液--液、及离子交换色谱）最适合的相对分子质量范围是20O～2000．对于相对分子质量大于2000的样品，则用尺寸排阻法为最佳．44现在是44页\一共有56页\编辑于星期四(2)根据溶解度选择如：样品可溶于水并属于能离解物质，以采用离子交换色谱为佳；如：样品可溶于烃类（如苯或异辛烷），则可采用液--固吸附色谱；45现在是45页\一共有56页\编辑于星期四（3）根据分子结构选择例如，酸、碱化合物宜用离子交换色谱；脂肪族或芳香族宜用液--液分配色谱或液--固吸附色谱；异构体用液--固吸附色谱；同系物用液--液分配色谱．等等46现在是46页\一共有56页\编辑于星期四分离类型选择总结，P37047现在是47页\一共有56页\编辑于星期四高效液相色谱仪应用实例

气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于400）的有机物原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析（这些物质几乎占有机物总数的75%～80%）。48现在是48页\一共有56页\编辑于星期四HPLC的应用

1.环境中有机氯农药残留量分析固定相：薄壳型硅胶流动相：正己烷流速：1.5mL/min

色谱柱：50cm2.5mm(内径)

检测器：示差折光检测器

可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。49现在是49页\一共有56页\编辑于星期四2.稠环芳烃的分析

稠环芳烃多为致癌物质。

固定相：十八烷基硅烷化键合相流动相：20%甲醇-水～100%甲醇线性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱温：50ºC

柱压：70104Pa

检测器：紫外检测器50现在是50页\一共有56页\编辑于星期四1.从分离原理、仪器构造及应用范围上简要比较气相色谱及液相色谱的异同点。解：二者都是根据样品组分与流动相和固定相相互作用力的差别进行分离的。从仪器构造上看，液相色谱需要增加高压泵以提高流动相的流动速度，克服阻力。同时液相色谱所采用的固定相种类要比气相色谱丰富的多，分离方式也比较多样。气相色谱的检测器主要采用热导检测器、氢焰检测器和火焰光度检测器等。而液相色谱则多使用紫外检测器、荧光检测器及电化学检测器等。但是二者均可与MS等联用。二者均具分离能力高、灵敏度高、分析速度快，操作方便等优点，但沸点太高的物质或热稳定性差的物质难以用气相色谱进行分析。而只要试样能够制成溶液，既可用于HPLC分析，而不受沸点高、热稳定性差、相对分子量大的限制。思考题解答4/8/202351