激光扫描共聚焦显微镜技术9

激光扫描共焦显微镜技术LaserScanningConfocalMicroscopyFruitFlyEmbryoNervousSystem现在是1页\一共有72页\编辑于星期四LaserScanningConfocalMicroscope现在是2页\一共有72页\编辑于星期四使用荧光物质标记细胞中的特定成分或结构，不仅图像与对比度增强，而且由于许多荧光显微镜的光源使用短波长的紫外光，大大提高了分辩率（δ=0.61λ/NA）。但当所观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微镜不仅接收焦平面上的光量，而且来自焦平面上方或下方的散射荧光也被物镜接收，这些来自焦平面以外的荧光使观察到的图像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生物学标本是层次区别的重叠结构）。1、普通荧光显微镜的不足现在是3页\一共有72页\编辑于星期四1水银弧光灯2中密度滤片3光镧4场镧5激发滤片6分光镜（BSP)7物镜8样品9,10发射滤片11目镜Basicsofconventionalfluorescencemicroscope现在是4页\一共有72页\编辑于星期四FluorescentMicroscopeObjectiveArcLampEmissionFilterExcitationDiaphragm-光圈Ocular-目镜ExcitationFilter现在是5页\一共有72页\编辑于星期四ConfocalPrincipleObjectiveLaserEmissionPinholeExcitationPinholePMTEmissionFilterExcitationFilter现在是6页\一共有72页\编辑于星期四Differencesbetweenconventionalandconfocalmicroscope1122观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微镜不仅接收焦平面上的光量，而且来自焦平面上方或下方的散射荧光也被物镜接收，这些来自焦平面以外的荧光使观察到的图像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生物学标本是层次区别的重叠结构）。现在是7页\一共有72页\编辑于星期四共聚焦显微镜一次只有样品的小部分区域被照明，而普通荧光显微镜则有更宽的区域被照明。现在是8页\一共有72页\编辑于星期四现在是9页\一共有72页\编辑于星期四现在是10页\一共有72页\编辑于星期四现在是11页\一共有72页\编辑于星期四2、共焦显微镜发展历史

1957年，MarvinMinsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美国的专利1967年，Egger和Petran成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面1977年，Sheppard和Wilson首次描述了光与被照明物体的原子之间的非线性关系和激光扫描器的拉曼光谱学现在是12页\一共有72页\编辑于星期四1984年，Biorad为公司推出了世界第一台商品化的共聚焦显微镜，型号为SOM-100，扫描方式为台阶式扫描1986年MRC-500型改进为光束扫描，用作生物荧光显微镜的共聚焦系统1987年White和Amos在英国《自然》杂志发表了“共聚焦显微镜时代的到来”一文，标志着LSCM已成为进行科学研究的重要工具现在是13页\一共有72页\编辑于星期四3、显微镜成像清晰度的决定因素:

1）.分辨率

2）.球差

3）.色差现在是14页\一共有72页\编辑于星期四1）、分辨率：

指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力,通常是用显微镜所能分辨清楚最近的相邻两点间的距离来表示。现在是15页\一共有72页\编辑于星期四人眼及各类显微镜的分辨率人眼分辨率：0.20mm光学显微镜分辨率：0.25mm共焦显微镜分辨率：0.18mm电子显微镜分辨率：0.20nm现在是16页\一共有72页\编辑于星期四2）、球差：

是由于透镜不能把近轴光线和远轴光线在光轴上共聚焦，以至透过标本一点的光线，在通过透镜时不能聚焦成一点,而是形成一个光斑,从而使成像模糊不清。现在是17页\一共有72页\编辑于星期四3）、色差：

是由于显微镜透镜类似于三棱镜,对不同颜色的光线具有不同的折射率。所以光线透过透镜后,不同色的光聚焦在不同点上,从而使成像模糊,而且像的边缘尚带有色晕。现在是18页\一共有72页\编辑于星期四现在是19页\一共有72页\编辑于星期四4、激光扫描共聚焦显微镜基本结构

激光扫描共聚焦显微镜系统主要包括扫描模块、激光光源、荧光显微镜、数字信号处理器、计算机以及图像输出设备等现在是20页\一共有72页\编辑于星期四激光共聚焦显微镜构成激光器光电倍增管检测器显微镜步进器计算机电子图像软件现在是21页\一共有72页\编辑于星期四现在是22页\一共有72页\编辑于星期四现在是23页\一共有72页\编辑于星期四（1）扫描模块

扫描模块主要由针孔光栏（控制光学切片的厚度）、分光镜（按波长改变光线传播方向）、发射荧光分色器（选择一定波长范围的光进行检测）、检测器（光电倍增管）组成。荧光样品中的混合荧光进入扫描器，经过检测针孔光栏、分光镜和分色器选择后，被分成各单色荧光，分别在不同的荧光通道进行检测并形成相应的共焦图象，同时在计算机屏幕上可以显示几个并列的单色荧光图象及其合成图象现在是24页\一共有72页\编辑于星期四（2）荧光显微镜系统

显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。显微镜光路以无限远光学系统可方便地在其中插人光学选件而不影响成像质量和测量精度。物镜应选取大数值孔径平场复消色差物镜，有利于荧光的采集和成像的清晰。物镜组的转换，滤色片组的选取，载物台的移动调节，焦平面的记忆锁定都应由计算机自动控制

现在是25页\一共有72页\编辑于星期四激光扫描共聚焦显微镜所用的荧光显微镜大体与常规荧光显微镜相同，但又有其特点：需与扫描器连接，使激光能进入显微镜物镜照射样品，并使样品发射的荧光到达检测器；需有光路转换装置，即汞灯与激光转换，同时汞灯光线强度可调现在是26页\一共有72页\编辑于星期四（3）常用激光器

激光扫描共聚焦显微镜使用的激光光源有单激光和多激光系统，常用的激光器包括以下三种类型:半导体激光器：405nm（近紫外谱线氩离子激光器：457nm、477nm、488nm、514nm（蓝绿光)氦氖激光器：543nm（绿光-氦氖绿激光器）633nm（红光—氦氖红激光器)现在是27页\一共有72页\编辑于星期四UV激光器（紫外激光器）：351nm、364nm（紫外光)风冷、水冷冷却系统及稳压电源4）辅助设备

现在是28页\一共有72页\编辑于星期四激光扫描共聚焦显微镜的基本工作原理是首先由激光器发射的一定波长的激发光，光线经放大后通过扫描器内的照明针孔光栏形成点光源，由物镜聚焦于样品的焦平面上，样品上相应的被照射点受激发而发射出的荧光，通过检测孔光栏后，到达检测器，并成像于计算机监视屏上。这样由焦平面上样品的的每一点的荧光图像组成了一幅完整的共焦图像，称为光切片基本工作原理现在是29页\一共有72页\编辑于星期四

从某种意义上讲，共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜，它对传统的光镜从以下几方面作了改进

现在是30页\一共有72页\编辑于星期四

1）、光源

用激光做光源，从理论上消除了色差。因为激光的单色性强、光源波束集中、波长相同。

2）、采用了共扼聚焦技术

在物镜的焦平面上放置了一个小孔，将焦平面以外的杂散光挡住，消除了球差。

现在是31页\一共有72页\编辑于星期四共扼聚焦原理图现在是32页\一共有72页\编辑于星期四激光器扩光器样品滤光片针孔检测器入射光发射光长通滤光片现在是33页\一共有72页\编辑于星期四入射光发射光长通滤光片激光器扩光器样品滤光片针孔检测器现在是34页\一共有72页\编辑于星期四入射光发射光长通滤光片激光器扩光器样品滤光片针孔检测器现在是35页\一共有72页\编辑于星期四

普通光学显微镜与激光共聚焦显微镜的区别现在是36页\一共有72页\编辑于星期四3）、点与面扫描技术

共聚焦显微镜：将样品分解成二维或三维空间上的无数点，用十分细小的激光束（点光源）逐点逐行扫瞄、成像，通过计算机软件组合，最后得到一个整体平面的或立体的像。

普通光镜：是在可见光源下一次性成像。现在是37页\一共有72页\编辑于星期四现在是38页\一共有72页\编辑于星期四Z

通过精细平面光切，形成生物样品不同平面的精细图象，将一个连续的光切图象Z轴重叠就可形成一个完整的三维图象现在是39页\一共有72页\编辑于星期四现在是40页\一共有72页\编辑于星期四现在是41页\一共有72页\编辑于星期四现在是42页\一共有72页\编辑于星期四现在是43页\一共有72页\编辑于星期四4）、图像信号及处理：

光电倍增管放大信号，计算机采集和处理光信号。

计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像，得到的图象是数字化的，可以在电脑中进行处理，再一次提高图象的清晰度。现在是44页\一共有72页\编辑于星期四5、共焦显微镜与传统显微镜的区别1）.抑制图像的模糊，获得清晰的图像现在是45页\一共有72页\编辑于星期四2）.具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片conventionalconfocal现在是46页\一共有72页\编辑于星期四3）.增加侧向分辨率

现在是47页\一共有72页\编辑于星期四4）.由于点对点扫描去除了杂散光的影响

现在是48页\一共有72页\编辑于星期四1）.点照明2）.具有照明pinhole和探测pinhole3）.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦),共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面4）.具有扫描系统——逐点扫描成像5）.具有多个（四个）荧光通道，可同时探测多个被标记物6、激光扫描共焦显微镜的设计特点现在是49页\一共有72页\编辑于星期四1）.xy分辨率比传统显微镜小1.4x

传统显微镜:Rxy=0.61/NA（0.25m)Confocal:Rxy=0.4/NA（0.18m)2）.样品的最大厚度:

取决于:物镜的NA、物镜的工作距离 激光的穿透力、样品的透明度

Z轴的最大移动范围(166m、Z-wide)3）.样品的最小光切厚度:(载物台最小移动距离为40nm）取决于:物镜的NA、针孔大小

Z轴的最小移动步距:40nm Z轴的分辨率:0.35m

7、技术指标（LeicaTCSSP2):

现在是50页\一共有72页\编辑于星期四4）.激光器

Ar激光器:458nm,476nm,488nm,514nmGreNe:543nm;HeNe:633nmAr激光器(UV):361nm

激光器的特点:1)方向性好:激光基本延直线传播

2)单色性好:=10-8nm3)高亮度:激光方向性好,其在空间上的能量分布是高度 集中的。

4)偏振性:激光为平面偏振光,光纤耦合现在是51页\一共有72页\编辑于星期四5）.四个荧光通道,一个透射光通道

即除了可同时采集多标记荧光图像外 还可以同时采集透射光图像,但透射光 图像为非共焦图像。现在是52页\一共有72页\编辑于星期四6）.扫描速度:slow220lines/s5125122-3秒

slow2440lines/s（2：双向扫描）

medium450lines/s5125121.7秒

medium2900lines/sfast1000lines/s

5125120.7秒

1281280.2秒

fast22000lines/s7）.扫描密度:

646412812851251210241024

20482048现在是53页\一共有72页\编辑于星期四8.共聚焦扫描显微镜的成像原理采用点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。两者的几何尺寸一致，约100-200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。现在是54页\一共有72页\编辑于星期四ConfocalPrinciple小孔光圈现在是55页\一共有72页\编辑于星期四共聚焦扫描显微镜的成像原理激光作为光源采用点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。扫描方式成像激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。光点共聚焦

光源和探测器前方都各有一个针孔（照明针孔和探测针孔）。直径约100-200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，最终同时聚焦于照明针孔和探测针孔。这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。现在是56页\一共有72页\编辑于星期四ConfocalPrinciple照明针孔探测针孔二色镜或分光镜激光光源现在是57页\一共有72页\编辑于星期四现在是58页\一共有72页\编辑于星期四现在是59页\一共有72页\编辑于星期四每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，这个光学横短面总是有一定厚度的，又称为光学薄片。由于焦点处的光强远大于非焦点处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的景深近似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，形成待观察样品聚焦光斑处二维的光学切片。把X-Y平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴）扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经过专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维图像。现在是60页\一共有72页\编辑于星期四观察方式：以荧光为主光源：激光（紫外、可见光、近红外）照明方式：点照明、逐点扫描成像方式：共聚焦、逐点成像输出：实时观测,数字化图像，可以进行图像处理和定量分析多重染色样品的观察LSCM的基本特点现在是61页\一共有72页\编辑于星期四

共聚焦显微镜真正的威力是依赖于其强烈抑制焦平面外荧光信号的能力，有很好的深度分辨能力或光学切片功能。基于该性质的应用包括:样品的显微断层扫描(microscopicCT)Z扫描切片的3-D重建厚样品的分辨率现在是62页\一共有72页\编辑于星期四

多通道同时检测，可实时检测细胞的生理活动和形态变化:生理学研究：如细胞内各种离子浓度随时间的变化情况.活细胞多种标记物同时进行成像，动态观察不同形态学事件的发生。如分泌颗粒的分泌过程。现在是63页\一共有72页\编辑于星期四实验青蛙冷丙酮、DAPI、甘油/PBS封片剂、滤纸、吸管、载玻片、盖玻片激光扫描共聚焦显微镜现在是64页\一共有72页