微生物基础实验技术回顾

微生物基础实验技术回顾第1页，共48页，2023年，2月20日，星期四2023/4/81第2页，共48页，2023年，2月20日，星期四消毒与灭菌消毒（disinfectant）

是指杀灭或清除传播媒介上的病原微生物，使之达到无害化的处理。（不一定包括芽孢）灭菌(sterilant)是指杀灭或清除传播媒介上的所有微生物（包括芽胞），使之达到无菌程度。第3页，共48页，2023年，2月20日，星期四常见的消毒灭菌方法化学消毒灭菌通过液体化学试剂杀灭微生物繁殖体或芽孢。消毒对象：物体表面、空气、污染物品等。消毒方式：擦洗、熏蒸、浸泡等。物理消毒灭菌包括高压蒸汽、紫外线、焚烧、HEPA过滤除菌等。第4页，共48页，2023年，2月20日，星期四化学消毒灭菌一、含氯消毒剂常用含氯消毒剂：次氯酸钠、二氯、三氯等常用剂型：粉剂、片剂、液体杀菌能力：高水平消毒；1000-5000mg/L浓度。适用范围：饮用水、餐饮具、果蔬、环境、物表、污水、污物、排泄物、分泌物注意事项：密闭干燥保存；消毒后去除残留；使用液不稳定，加盖，有效期；对织物漂白，对金属腐蚀用；操作时应做好个人防护。第5页，共48页，2023年，2月20日，星期四化学消毒灭菌二、过氧乙酸

酸性透明液体，易挥发易分解，爆炸危险。杀菌能力：灭菌，高水平消毒适用范围：餐饮具、果蔬、环境、物表、空气。薰蒸消毒：18-20%过氧乙酸5-6ml（1g）/m3，放瓷或玻璃容器中，加热密闭薰蒸1-2h。喷雾消毒：0.1-0.5%，20ml/m3，作用1h。注意事项：性质不稳，用前配，有盖塑料容器；对金属腐蚀，对织物漂白作用；操作时应做好个人防护；消毒完成后用清水去除残留。第6页，共48页，2023年，2月20日，星期四化学消毒灭菌三、乙醇

别名酒精，无色透明液体，易挥发，易燃烧。杀菌能力：中水平消毒适用范围：手、皮肤、小面积物表、医疗器械使用方法：手与皮肤用75%溶液擦拭1min

物表用75%溶液浸泡或擦拭10min以上注意事项：乙醇易燃，忌明火；可使蛋白质变性凝固形成

保护层，消毒前应将物品表面的有机物清除，

不宜用于被血、脓、粪便等污染表面消毒；破

坏仪器胶粘物与镜头，橡胶塑料变硬膨胀。第7页，共48页，2023年，2月20日，星期四物理消毒灭菌一、热力消毒和灭菌

是最可靠、首选的消毒灭菌方法。分为湿热消毒和灭菌以及干热消毒和灭菌。适用范围：耐热物品的消毒和灭菌。常见类型：湿热消毒灭菌主要采用高压蒸汽灭菌。E.g.：手提式高压蒸汽灭菌器。用于微生物实验

和少量培养基灭菌，一般0.105MPa在25

到30分钟即可。

干热消毒灭菌，一般用于破璃仪器如试管、三角

瓶、培养皿等,灭菌温度在160℃,维持60分钟。

第8页，共48页，2023年，2月20日，星期四物理消毒灭菌二、紫外线辐射灭菌

可达高水平消毒，使用方便；但由于对人皮肤黏膜有刺激作用，并产生臭氧，在有人情况下使用受到限制。适用范围：室内空气消毒、水的消毒、能直接照射到的光滑物体表面的消毒。紫外线在水中穿透力随着深度的增加而降低第9页，共48页，2023年，2月20日，星期四物理消毒灭菌三、高效过滤除菌

高效过滤除菌技术，对空气中≤0.3μm颗粒与微生物的阻留率能达到99.97%以上。适用范围：主要用于生物安全柜与生物安全实验室的空气净化除菌。注意事项：*必须定期更换高效过滤器（HEPA），*更换前应先用甲醛或过氧乙酸进行熏蒸消毒，*更换时严格做好工作人员防护；*换下的过滤装置装入密封袋内由具有资质的单位焚烧处

理。第10页，共48页，2023年，2月20日，星期四消毒与灭菌的区别消毒只要求场所与物品达到无害化水平，而灭菌则要求达到没有一个活菌存在。两者选用的处理方法不同。灭菌与消毒相比，要求更高，处理更难。应用的场所与处理的物品也不同。第11页，共48页，2023年，2月20日，星期四无菌操作技术无菌操作技术：指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。无菌操作目的：保证待检物品不被环境中微生物污染；防止被检微生物在操作中污染环境或感染操作人员。第12页，共48页，2023年，2月20日，星期四无菌操作技术1．接种针2.接种环3.接种钩4.5.玻璃涂棒6.接种圈7.接种锄8.小解剖刀无菌操作材料：接种工具第13页，共48页，2023年，2月20日，星期四无菌操作技术无菌操作材料：材料器械和用品：酒精灯、记号笔、标签、火柴、灭菌培养皿、无菌水、试管架菌种培养基：第14页，共48页，2023年，2月20日，星期四无菌操作技术（1）在操作中不应有大幅度或快速的动作；（2）使用玻璃器皿应轻取轻放。（3）在火焰上方操作；（4）接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；（5）在接种培养物时，协作应轻、准。（6）不能用嘴直接吸吹吸管。（7）带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒。无菌操作的要求：第15页，共48页，2023年，2月20日，星期四无菌操作技术第16页，共48页，2023年，2月20日，星期四无菌操作技术第17页，共48页，2023年，2月20日，星期四微生物接种、分离纯化与培养

接种（inoculate/vaccinate）

是指按无菌操作技术要求将目的微生物移接到培养基质中的过程。

微生物的分离纯化（

isolationandpurificationof

microorganisms）将特定的微生物个体从群体中或从混杂的微生物群体中分离出来的技术叫作分离；在特定环境中只让一种来自同一祖先的微生物群体生存的技术叫作纯化。

微生物培养（microculture)是生物培养的中的一种。所培养的微生物主要有病毒、细菌、放线菌、真菌等。第18页，共48页，2023年，2月20日，星期四微生物的接种方法接种的基本程序灭菌接种环沾取标本接种灭菌接种环杀灭接种环沾染的微生物，以免污染标本杀灭接种环沾染的微生物，以免污染环境操作需在无菌室或超净工作台内进行无菌室、超净工作台使用前后需进行消毒。实验使用的物品使用前后需严格灭菌第19页，共48页，2023年，2月20日，星期四微生物的接种方法一、斜面接种

将已长好微生物移接到另一斜面管的方法。此法用于好气性微生物的接种。左手持菌种管和斜面管，使斜面向上，并尽量放平。用右手先将塞拧转松动，再拿接种环，用右手的小指、无名指和手掌拨下塞并夹紧，同时将管口在火焰上燃烧一圈，接种环灼烧灭菌后插入管内，冷却、挑菌，立即转入斜面管底部，沿斜面划曲线或直线。第20页，共48页，2023年，2月20日，星期四微生物的接种方法一、斜面接种1.两支试管呈“V”字形

2.拔下试管塞3.火焰上微烧一周

4.接种环灼烧、冷却5.接种、划线

6.塞上塞子，灼烧接种环第21页，共48页，2023年，2月20日，星期四微生物的接种方法二、液体接种将菌接种到液体培养基（试管、三角瓶等）中的方法。操作与上法基本一致，只是在将接种环送入液体培养基中时使环在液体与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，然后塞上棉塞，再轻轻摇动均匀，即可培养。如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或接种环接种。第22页，共48页，2023年，2月20日，星期四微生物的接种方法三、穿刺接种用接种针以无菌操作挑取少许菌体穿刺与半固体培养基中间，刺至管底，再按原途退出。穿刺时要做到手稳、动作轻巧、快速；塞紧棉塞后，放入37℃恒温培养箱内培养24小时观察结果。此法用于厌气性细菌接种、检查细菌的运动能力。

第23页，共48页，2023年，2月20日，星期四微生物的接种方法四、划线接种目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌、活菌计数。方法：★分区划线法：适用于含菌量较多的标本★连续划线法：适用于含菌量较少的标本第24页，共48页，2023年，2月20日，星期四微生物的接种方法四、划线接种第25页，共48页，2023年，2月20日，星期四微生物的接种方法四、划线接种分区划线法第一区划线灭菌接种环第二区划线灭菌接种环第三区划线灭菌接种环第26页，共48页，2023年，2月20日，星期四微生物的接种方法四、划线接种连续划线法第27页，共48页，2023年，2月20日，星期四微生物的分离纯化原理是将待分离的样品进行一定的稀释，使之分散，在固体培养基上形成单个菌落，再转接到适当的培养基上，就认为是纯种。

分离培养成纯种菌的方法有平板划线法、倾注平板法和动物接种分离法等，其中以平板划线法最为常用。第28页，共48页，2023年，2月20日，星期四微生物的分离纯化一、平板划线法倒平板挑取菌落划线注意：划线完毕，将琼脂平板培养基倒置，并在培养皿底玻璃上，用记号笔注明接种菌名、接种者姓名及班级、日期等，将培养皿倒置放在恒温箱培养，以避免培养过程中凝结水自皿盖滴下。判定合格标准：如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。第29页，共48页，2023年，2月20日，星期四微生物的分离纯化一、平板划线法平板划线法的示意图见图1：AB是最常使用的、最基本的方法，其中图B常用于含菌量较少的标本。第30页，共48页，2023年，2月20日，星期四微生物的分离纯化一、平板划线法图2分区划线法示意图

三段分区法四段分区法第31页，共48页，2023年，2月20日，星期四微生物的分离纯化一、平板划线法

五段分区法培养后情况第32页，共48页，2023年，2月20日，星期四微生物的分离纯化一、平板划线法

单菌落（clone)菌落（R型）菌苔(lawn)细菌的群体形态第33页，共48页，2023年，2月20日，星期四微生物的分离纯化二、稀释分离法第34页，共48页，2023年，2月20日，星期四微生物的分离纯化二、稀释分离法1.取无菌生理盐水（NaCl0.85%)试管三支（每支4.5ml)，编号Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ；2.无菌操作取混合菌液一环于Ⅰ中，摇匀；3.同法自Ⅰ管至Ⅱ，自Ⅱ管至Ⅲ；4.用1ml无菌吸管，分别从Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ管中吸取0.2ml于三个无菌培养皿中，编号；5.倒入熔化冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基15ml左右，轻轻摇匀，待凝后倒置于37℃恒温培养箱中培养24-48小时观察结果。第35页，共48页，2023年，2月20日，星期四微生物的培养一、培养基人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质称培养基。

培养基的基本成分一般的培养基均需要碳源、氮源、无机盐和水等第36页，共48页，2023年，2月20日，星期四微生物的培养二、培养基的种类第37页，共48页，2023年，2月20日，星期四微生物的培养物理状态固体培养基液体培养基半固体培养基适用范围广，用于菌种的分离纯化、鉴定、活菌计数、检验杂菌、选种及菌种保藏等。在实验室及微生物大规模的工业生产中用途广泛。用于细菌运动状态的观察、趋化性研究、厌氧菌的培养以及细菌和酵母菌的菌种保藏等。第38页，共48页，2023年，2月20日，星期四微生物的培养功能选择培养基鉴别培养基加富培养基根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基。几种细菌由于对培养基中某一成分的分解能力不同,其菌落通过指示剂显示不同的颜色而被区分开。在培养基中加入有利于某种微生物生长繁殖所需的营养物质，使这类微生物的增殖速度比其他微生物快。第39页，共48页，2023年，2月20日，星期四微生物的培养成分合成培养基天然培养基复合培养基成分精确，价格较贵，通常适用于营养、代谢、菌种鉴定或生物测定等对定量要求较高的工作中。营养丰富，配制方便，培养效果好。但是成分不明确，实验可重复性差。一类既有已知的化学组成物质，同时还加有某些天然成分而配置的培养基。第40页，共48页，2023年，2月20日，星期四菌种的保藏第41页，共48页，2023年，2月20日，星期四菌种的保藏一、斜面低温保藏法将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此循环。●适用范围：细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种。●优缺点：优点是简便易行，容易推广，存活率高，故科研和

生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法。其缺点是

菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，

菌种较容易发生变异和被污染。第42页，共48页，2023年，2月20日，星期四菌种的保藏二、冷冻真空干燥保藏法通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空条件下立即融封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物质。●适用范围：除不产孢子的丝状真菌不宜用此法外，其他大多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等均可采用这种保藏方法。●优缺点：优点是保藏期长，一般达5～15年，存活率高，变异率低。缺点是该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。第43页，共48页，2023年，2月20日，星期四菌种的保藏三、液氮超低温保藏法它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（-196℃）下保藏的方法。其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。●适用范围：适用于各种微生物菌种的保藏，甚至连藻类、原生动物、支原体等都能用此法获得有效的保藏。●优缺点：优点是操作简便、高效、保藏期一般可达到15年以上，可使用各种培养形式的微生物进行保藏，无论是孢子或菌体、液体培养物或固体培养物均可采用该保藏法。其缺点是需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高。第44页，共48页，2023年，2月20日，星期四菌种的保藏四、石蜡油封藏法将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此循环。●适用范围：霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等，对霉菌和酵母菌的保藏效果较好。●优缺点：优点是操作简单；缺点是对很多厌氧性细菌的保藏效果较差，尤其不适用于某些能分解烃类的菌种第45页，共48页，2023年，2月20日，星期四