蛋白质化学8优秀公开课件

第五节

蛋白质的高级结构

清华P36华中P97蛋白质的高级结构又称空间结构、三维结构。指的是蛋白质分子中原子和基团在三维空间上的排列、分布及肽链的走向。实际上就是蛋白质的构象（构象和构型不同），分为二、三、四级结构。二级结构是蛋白质多肽链本身在空间盘绕（旋转）或折叠的方式；（清华P37华中P97）三级结构是在二级结构基础上进一步折叠或卷曲；（清华P45华中P103）四级结构是含有亚基或亚单位的蛋白质亚基与亚基之间的结合方式。（清华P48华中P105）一、基本概念二、稳定蛋白质三维结构的作用力1、氢键：维系蛋白质二级结构的主要作用力.大多数蛋白质的折叠策略是：主链肽键之间形成最大数目的分子内氢键，而侧链与水相作用.2、范德华力：分子间的相互作用力.它包括三种效应：定向效应、诱导效应、分散效应.3、疏水相互作用：水介质中球形蛋白质的折叠倾向于把疏水残基埋藏在分子内部.维系三、四级结构的主要作用力。三、二级结构（清华P37华中P97）二级结构只是指蛋白质的肽链有规则的几何走向，限于主链原子的局部空间排列，不包括与肽链其他区段的相互关系几侧链构象。多肽链折叠的规则方式：

1、-螺旋

2、-折叠

3、-转角

4、凸起、无规卷曲

（一）-螺旋（华中P99）研究α-角蛋白时发现1、结构特点：每隔3.6个氨基酸残基，螺旋上升一圈。螺旋沿螺旋体的中心轴每上升一圈相当于向上移动0.54nm,即每一个氨基酸残基沿轴上升0.15nm。螺旋上升时每个残基沿轴旋转；螺旋体中氨基酸残基侧链伸向外侧，相邻的螺圈之间形成链内氢键，氢键的取向几乎和中心轴平行；氢键是由每个氨基酸残基与其前面的第四个氨基酸残基形成的。3、影响-螺旋形成的因素：A、侧链基团的电荷性质例如：多聚丙氨酸侧链基团pH7不带电荷，可在水中自发卷曲成螺旋，多聚赖氨酸则不然，此时赖氨酸带正电荷使之不能卷曲。静电排斥不能形成氢键。在pH12时自发形成-螺旋。多聚谷氨酸也有类似情况。B、侧链基团的大小：R基大小对多肽链能否形成-螺旋也有影响。多聚异亮氨酸有大的侧链基团，造成空间位阻不能形成-螺旋。多聚脯氨酸具亚氨基，不能形成氢键。只要存在脯氨酸，-螺旋即被中断，并产生一个：“结节”。（二）、-折叠：是指一种相当伸展的结构，研究β-角蛋白时发现。C、氢键是肽链与肽链之间（或一条肽链不同肽间）形成的，几乎所有肽键都参与链间氢键交联。氢键与肽键长轴接近垂直，有重复单位。D、有两种形式，相邻两条链的N末端在同一端的为平行式，不在同一端的为反平行式。反平行稳定，自然界中多，平行不稳定。（三）-转角-转角又称-弯曲、发夹结构一种非重复性结构，4个连续的氨基酸残基组成。第一个残基的CO基与第四个残基的NH基形成氢键，主链骨架以180°返回折叠。大致分为三种情况：Ⅰ的4个Ca不在同一个平面上；Ⅰ和Ⅱ的的关系在于中心肽单位旋转了180°，Ⅱ中的第三个氨基酸几乎都是Gly;Ⅲ是在第一个和第三个残基之间形成一小段螺旋。（四）凸起、无规卷曲：1、凸起（Ω环）：一种小片段的非重复性结构。大多数经常作为反平行折叠中的一种不规则情况。由6个至16个残基组成的环，几乎总是位于蛋白表面，在生物识别工程中可能起重要作用。四、超二级结构和结构域（一）超二级结构该概念是1973年由M.Rossmann提出。定义：若干相邻的二级结构单元（螺旋、折叠、转角）按照一定规律有规则地组合在一起，彼此相互作用，形成、在空间结构上能彼此区别的的二级结构组合体。该组合体可作为三级结构的元件。连接环(loop)ααββββ-曲折(β-meander)希腊钥匙(Greekkeytopology)βαβ（二）、结构域蛋白质三维折叠的一个层次。多肽链首先形成二级结构，相邻的二级结构片段组装在一起形成超二级结构，进而多肽链折成近乎球形的结构。对于较大的蛋白质分子和亚基，多肽链往往有两个以上相对独立的三维实体，这种相对独立的三维实体就是结构域。结构域进一步缔合就形成三级结构：多肽链二级结构超二级结构结构域三级结构五、三级结构（清华P45华中P103）（一）三级结构的概念：蛋白质的三级结构是指一条多肽链在二级结构基础上进一步卷曲折叠，构成一个不规则的特定构象，它包括全部主链、侧链在内的所有原子的空间排布，但不包括肽链之间的相互作用。球状蛋白质比纤维状蛋白质的构象复杂得多，它们具有多种多样的生物功能。球状蛋白质结构多样导致功能的多样性球状蛋白质的三级结构是由二级结构单元恰当配置而成，只有三级结构才是蛋白质生物活性的特征构象系。活性是动态的、柔性的，而不是刚性的、静止的。

（二）氨基酸顺序决定蛋白质的三级结构

氨基酸顺序决定多肽链的二级结构，也就是说只有相邻的氨基酸残基具有适当的侧链基团时，才能自发地形成螺旋和折叠，并处于稳定状态。即一级结构决定二级结构球状蛋白质的三级结构也决定于氨基酸顺序。氨基酸短顺序决定二级结构。氨基酸长顺序决定三级结构。氨基酸的精确位置决定多肽的转弯的方向和角度。P107(四）三级结构实例--肌红蛋白的

结构与功能1、肌红蛋白的三级结构肌红蛋白分布在肌肉中起着储存氧的功能，以便氧在肌肉中的移动。肌红蛋白有紧密的结构和高含量的-螺旋。分子呈扁平棱形的球状结构，内部很少有空隙。

血红素模型：3、氧与肌红蛋白的结合血红素位于肌红蛋白分子的一个沟缝中。

一氧化碳中毒的原理：CO同氧气竞争结合部位。4、氧的结合改变肌红蛋白的构象X射线晶体学分析：肌红蛋白结合氧与不结合氧构象不同六、四级结构（清华P48华中P105）（一）、有关四级结构概念：１、亚基：由两条或两条以上的具有三级结构的多肽链聚合而成特定构象的蛋白质分子，其结构最小共价键单位称为亚基或亚单位。亚基一般是一条多肽链，亚基有时也称单体。2、寡聚蛋白：由亚基聚合而成的蛋白质称为寡聚蛋白。分为同多聚蛋白、杂多聚蛋白。3、四级结构：各个亚基在蛋白质分子的天然构象中的空间排布方式及亚基间的相互作用关系，而不包括亚基本身的构象。亚基通过非共价键缔合在一起。4、单体：分为几种情况：①仅由一条肽链构成的蛋白质称为单体②寡聚蛋白中的一条肽链为一个单体（此时即亚基）③蛋白质聚合体中的重复单位，此时蛋白质分子本身为单体。5、原体：在寡聚蛋白分子中具有一套不同结构和功能亚基的最小单位。（二）、四级结构的驱动力范德华力氢键离子键疏水作用二硫键其中主要为疏水作用。（三）、四级结构举例----血红蛋白的结构血红蛋白的结构血红蛋白由四个亚基组成，分子是一个球体，四个亚基占据四面体的四个角。血红素辅基位于分子表面的空穴内，每个亚基一个。四个氧的结合部位彼此保持一定的距离。血红素同蛋白的结合类似肌红蛋白

第六节蛋白质的结构与功能的关系华中P108蛋白质分子具有多样的生物学功能，需要一定的化学结构，还需要一定的空间构象。一、蛋白质一级结构与功能的关系1.种属差异蛋白质一级结构的种属差异十分明显，但相同部分氨基酸对蛋白质的功能起决定作用。根据蛋白质结构上的差异，可以断定它们在亲缘关系上的远近。2.分子病——蛋白质分子一级结构的氨基酸排列顺序与正常有所不同的遗传病。血红蛋白的分子病---镰刀状细胞贫血病镰刀状细胞贫血病是最早被认识的一种分子病在非洲某些地区流行，由遗传基因的突变导致血红蛋白分子中氨基酸残基被更换造成，反映了氨基酸顺序决定二、三、四级结构中的作用。患者血红蛋白含量和红细胞数仅为正常人的一半，红细胞中有大量的镰刀状或新月形细胞。脱氧时镰形红细胞明显增加，细胞的变形是由不正常的血红蛋白分子造成的。镰刀状红细胞血红蛋白的氨基酸顺序的变化造成不正常血红蛋白分子。镰刀状细胞血红蛋白的氨基酸序列的细微变化：链6位AA:Glu

Val镰刀状细胞贫血（sick-cellanemia）从患者红细胞中鉴定出特异的镰刀型或月牙型细胞。β-链1234567Hb-AVal-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys…Hb-SVal-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys…

Val取代Glu含氧-HbAO2O2粘性疏水斑点含氧HbS脱氧HbS疏水位点血红蛋白分子凝集二、蛋白质空间结构与功能的关系别（变）构作用——含亚基的蛋白质由于一个亚基的构象改变而引起其余亚基和整个分子构象、性质和功能发生改变的作用。因别构而产生的效应称别构效应。变构蛋白——可通过改变其构象来改变其生物活性的蛋白称为变构蛋白。变构蛋白有2种不同的构象：无活性（或低活性）与有活性（或高活性）举例1、肌红蛋白：氧的结合改变构象肌红蛋白分子动力学蛋白质是柔性的、快速涨落的分子，对结构运动性具有功能上的重要意义。图示：以间隔5×10-12S计算的几个蛋白质“快照”重叠图。蓝色为骨架，黄色为血红素，连接血红素与蛋白质的His侧链为橙色。举例2、柠檬酸合酶：

构象变化对底物的改变(a)开放构象。(b)关闭的底物结合构象。在酶的每个亚基中，小结构域的碳原子为绿色，大结构域的碳原子为洋红色。两个结构域的氮原子、氧原子和硫原子分别为蓝色、红色、和黄色。开放型和关闭型之间的构象变化，原子间的相对移动需达到1.5nm。构象的变化产生了乙酰CoA的结合位点，并封闭了草酰乙酸的结合位点。1）氢离子、二氧化碳和二磷酸甘油酸(BPG)对血红蛋白(Hb)结合氧的影响A、影响结果氢离子增加，二氧化碳增加促进血红蛋白氧的释放氧气增加，氢离子减少促进血红蛋白与氧气结合。BPG降低血红蛋白对氧气的结合。举例3、血红蛋白：B、生理意义：在肌肉中pH=7.2有利于血红蛋白释放氧气。.在肺中pH=7.6，有利于血红蛋白释放二氧化碳，结合氧。人在生理和病理缺氧可以通过细胞中的BPG的浓度改变组织的获氧量。例如高山适应代偿性变化：正常人在海平面上升到4500米高的高空时，红细胞中的BPG可以在两天之内由4.57.5mmol/L，并引起氧亲和力的降低。BPG浓度升高对肺部氧的结合影响不大，但大大影响了对组织中氧的释放。2）血红蛋白构象的变化X射线分析：血红蛋白有两种构象状态，T态和R态T态（蓝色）——紧张态,去氧合血红蛋白主要构象.结合氧气→R态。R态（红色）——松弛态，氧合血红蛋白主要构象。失去氧气→T态。Fe移进非锥形的卟啉环的平面，可更紧密结合O2，而且拉着HisF8和F螺旋第七节

蛋白质的性质华中P111蛋白质在其等电点偏酸溶液中带正电荷，在偏碱溶液中带负电荷，在等电点pH时为两性离子。一、蛋白质的两性解离及等电点当溶液pH使蛋白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，即蛋白质分子本身的净电荷为零时，这时的pH值即为该蛋白质分子的等点电（pI）。注意：1.蛋白质在pI时，虽然净电荷为零，但所带电荷量最大。2.测pI时一定在缓冲液中，离子强度的改变，可以使pI改变，所以平时写pI时，要指明缓冲液的种类、离子强度、缓冲液的pH值，否则是不够正确的。3.含碱性氨基酸多的蛋白质，pI偏碱，含酸性氨基酸多的蛋白质，pI偏酸；两者差不多的时一般偏酸（COOH的解离度比NH3+的解离度大）。4.pI时，蛋白质较稳定，溶解度最小，蛋白质在不含其它溶质的纯水中的pI称为等离子点，等离子点对某一蛋白质只有一个数值。等离子点实际上就是蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH。二、蛋白质的胶体性质属于亲水胶体，具有布朗运动、丁达尔现象、电泳现象，半通透性等亲水胶体性质。利用半通透性性质可与小分子分开——透析蛋白质溶液稳定的原因：

1）表面形成水膜（水化层）；

2）带相同电荷。三、蛋白质的沉淀作用破坏蛋白质胶体溶液的稳定性，将影响蛋白质的溶解性质，蛋白质能够从溶液中沉淀出来，称为蛋白质的沉淀作用。常用沉淀方法：加高浓度的盐类加有机溶剂调pH至等点电加重金属盐加某些酸加生物碱试剂（单宁酸、苦味酸、三氯乙酸等）加热（凝固）最常用方法蛋白质沉淀示意图1、不可逆沉淀在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀2、可逆沉淀在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。四、蛋白质的变性作用清华P50华中P115某些物理或化学因素，能够破坏维持蛋白质高级结构的氢键、盐键等次级键，使蛋白质分子内部结构发生改变，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性作用。(denaturation）发生变性的蛋白质一级结构（构型）和分子量不变，高级结构（构象）遭到破坏。有些蛋白质的变性作用是可逆的，其变性如不超过一定限度，经适当处理后，可重新变为天然蛋白质（复性作用）。变性蛋白质主要标志：生物学功能的丧失，溶解度降低，黏度增大，易形成沉淀析出，分子扩散速度减慢，渗透压降低，结晶能力丧失，分子形状改变，肽链松散，反应基团增加，易被酶消化。变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，一般来说，不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。变性作用蛋白质复性五、蛋白质的别构作用

含亚基的蛋白质由于一个亚基的构象改变而引起其余亚基和整个分子构象、性质、功能发生改变的作用称别构作用，分为正别构和负别构2种情况六、蛋白质的免疫学性质对于外来大分子，动物体内可以产生一种蛋白质，使动物不产生生理功能紊乱。外来大分子称为抗原，所产生的蛋白质称为抗体反应名称试剂颜色反应有关基团有此反应的蛋白质或氨基酸双缩脲反应NaOH、CuSO4紫色或粉红色二个以上肽键所有蛋白质米伦反应HgNO3、Hg(NO3)2及HNO3混合物红色

Tyr黄色反应浓HNO3及NH3黄色、橘色

Tyr、Phe乙醛酸反应(Hopking-Cole反应)乙醛酸试剂及浓H2SO4紫色

Trp坂口反应(Sakaguchi反应)α-萘酚、NaClO红色胍基Arg酚试剂反应(Folin-Cioculteu反应)碱性CuSO4及磷钨酸-钼酸蓝色酚基、吲哚基Tyr茚三酮反应茚三酮蓝色自由氨基及羧基α-氨基酸

七、蛋白质的颜色反应P116—OHN第八节

蛋白质的分离纯化测定

清华P27华中P117一、蛋白质分离纯化的一般原则1、分离纯化过程中注意提高产量；2、注意保持蛋白质原有的天然状态；3、根据分离纯化目的，选择合适的材料，破碎组织或细胞；4、首先将蛋白质和非蛋白质物质分离；5、采用适当的方法进行分离纯化。1、透析和超过滤透析和超过滤都是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质分开。超过滤是利用压力或离心力，强使水和其它小分子溶液透过半透膜，而蛋白质留在膜上。二、蛋白质分离纯化的方法（一）根据分子大小不同进行分离纯化透析与超过滤简易装置2、密度梯度离心蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，各种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质时即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成各自独立的区带。最后分部收集。3、凝胶过滤层析（分子排阻层析、分子筛层析）凡是利用生物大分子的相对分子质量差异进行层析分离的方法，均称之为排阻层析。最有效分离方法之一。用于层析的分离介质称为排阻层析介质。介质为高度水化的惰性多聚物：葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等。目前已成为生物化学、分子生物学和生物制药在研究和生产中必不可少的分离介质。凝胶层析的原理

凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。凝胶的交联度（网孔的大小）决定了凝胶的分级范围。（二）根据溶解度差别的分离方法1.等电点沉淀法P118

利用各种蛋白质在等电点时，溶解度最小这一性质，可以通过调节蛋白质溶液的PH值，将不同的蛋白质分开。2.有机溶剂沉淀法P118

在水中加入介电常数低的、与水互溶的有机溶剂（乙醇、丙酮），水溶液的介电常数降低，同时也破坏了水化膜，使蛋白质分子趋于凝集、沉淀。影响蛋白质溶解度的外界因素：溶液的pH、离子强度、介电常数、温度3.盐溶或盐析中性盐在低浓度时，可以增加蛋白质的溶解度，这种现象叫盐溶。当溶液离子强度增加到一定数值时，蛋白质的溶解度下降开始沉淀，这种现象叫盐析。盐溶原因：盐离子增加了水溶液的极性，减弱了蛋白质分子间的作用力。从而促进溶解。

盐析原因：高浓度的盐与水结合后降低了水的相对浓度，争夺了蛋白质分子水化膜的水分子，并且中性盐完全解离使离子强度增高，中和了蛋白质的表面电荷，使之沉淀析出。常用分段盐析的方法。（三）根据电荷不同的分离方法主要是电泳和离子交换层析1.电泳在外界电场的影响下，如果蛋白质不处于等电点状态，它将向电极移动，这种现象称为电泳。分子大小不同的蛋白质所带净电荷密度不同，迁移率则不同，在电泳时可以分开。纯化中应用最多的是聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳，它们既可以作为蛋白质纯度检验方法，也可以纯度、制备蛋白质。（迁移率）μ＝───────V（移动速度：cm/sec)E(电场强度：伏特/cm）常用电泳方法：

1）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。2）平板电泳：铺有凝胶的玻板上进行的电泳。+

—-+3）等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。++－－－－+－－－－－5.06.07.0稳定pH梯度5.06.07.0稳定pH梯度通电++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－常见垂直平板电泳示意图4）2.离子交换层析常用的离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素（CM一纤维素）和弱碱性的二乙基氨基乙基纤维素（DEAE一纤维素），前者为阳离子交换剂，后者为阴离子交换剂。离子交换层析原理及简单流程：

离子交换剂的结合力取决于彼此间相反电荷的静电吸引，这与溶液的pH值有关，因为溶液的pH值决定离子交换剂与蛋白质的电离程度。盐类的存在可以降低离子交换剂的离子和蛋白质的相反电荷基团之间的静电吸引。因此，蛋白质混合物的分离可用改变溶液中盐类离子强度和pH值来完成。对离子交换剂结合力最小的蛋白质首先由层析柱中洗脱出来。分段洗脱——洗脱剂跳跃式的分段改变；梯度洗脱——洗脱剂渐进式的连续改变离子交换原理及流程示意图二、蛋白质的纯化方法1.选择吸附纯化某些物质（如极性的硅胶和氧化铝、非极性的活性炭）的粉末具有吸附能力，可将其他种类分子吸附在其粉末表面，利用不同物质吸附力的强弱的不同达到分离纯化的目的。蛋白质提纯中使用最广泛、最有效的吸附剂是羟基磷灰石（hydroxyapatite,简写HA）：Na2HPO4＋CaCl2─→CaHPO4·H2O─→HANaOH洗脱液为磷酸缓冲液2.亲和层析亲和层析(affinitychromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法。亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物质可逆性特异结合的化合物（称配体）连接到某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱，当待提纯的生物大分子通过此层析柱时，此生物大分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其他物质则被冲洗出去。然后再用适当方法使这种生物大分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分离提纯的目的。配体蛋白质蛋白质和配体复合物交联试剂载体配体载体与配体交联体杂质杂质游离配体亲和层析原理及流程示意图三蛋白质的测定与纯度鉴定（一）蛋白质含量的测定：1.凯氏定氮法根据蛋白质平均含氮量为16%，分析氮的含量后计算蛋白质的含量。具体操作：硫酸消化样品后产生的硫酸铵加氢氧化钠产生氢氧化氨，蒸馏出氨气，用硼酸吸收，再用强酸滴定。

2.双缩脲法在强碱性溶液中，蛋白质与CuSO4反应，生成紫红色化合物，这个反应称为双缩脲反应（biuretreaction)。在碱性条件下，蛋白质与CuSO4所生成的颜色深浅与蛋白质的浓渡成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸组成无关。将样品同标准蛋白质同时试验，并于540--560nm波长下侧其光吸收值，通过标准曲线即可求得蛋白质的含量。此方法简便、迅速，不受蛋白质特异性的影响，但方法的灵敏度较差，所需样品量大（0.2-1.7mg/ml）。3．福林一酚试剂法福林一酚试剂（Folin-phenolreagent)包括两组试剂：碱性铜试剂和磷钼酸及磷钨酸的混合试剂。碱性铜试剂与蛋白质产生双缩脲反应，这是蛋白质中肽键的反应，这种被作用的蛋白质中的酚基（酪氨酸），在碱性条件下很容易将磷钼酸和磷钨酸还原为蓝色的钼蓝和钨蓝，所生成蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，因此在650nm或660nm波长下测定光吸收值，即可测定蛋白质含量。这个方法实际上是劳里（Lowry,O,H.,1951）在原方法的基础上加以改进了的，常称Lowry法，具有操作简便、灵敏度高（比双缩脲法灵敏100倍）等优点。蛋白质测定范围为25---250µg/ml。但不同蛋白质显色强度稍有不同，而且酚类物质和柠檬酸有干扰。

4.紫外吸收法

蛋白质分子中酪氨酸、色氨酸在280nm左右具有最大吸收，在各种蛋白质中这两种氨基酸含量差别不大，所以280nm的吸收值与浓度具正相关，可用于蛋白质含量的测定。但若样品蛋白质中酪氨酸含量与标准蛋白质比较差别较大，则测定有一定误差；其它具有紫外吸收的物质（如核酸类）有干扰。另外，280nm和260nm吸收差法也常用于蛋白质含量的测定。在被测样品中常含有核酸类物质。利用核酸类物质的吸收值在260nm大于280nm，而蛋白质的吸收值在280nm大于260nm的特性，可分别于280nm和260nm波长下测定光吸收值（分别以A280和A260表示）。然后按下列经验公式计算蛋白质的含量：蛋白质浓度（mg/ml)＝1.45A280－0.74A260

（二）蛋白质纯度的鉴定纯度鉴定方法很多，例如：电泳分析、沉降分析、扩散分析、恒溶度法等。最常用的是利用聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳法鉴别蛋白质的纯度。属于不连续凝胶电泳，上为浓缩胶，胶浓度为2.5%，孔径大；下为分离胶，胶浓度为7.5%，孔径小；样品中常加十二烷基硫酸钠（简称SDS）+

—（三）蛋白质分子量的测定测定分子量的主要方法有渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。1.超离心法最准确可靠的方法是超离心法（Svedberg于1940年设计）：蛋白质颗粒在25~50×104g离心力作用下从溶液中沉降下来。沉降系数s：单位离心力场下的沉降速度。单位为秒（s）沉降系数的单位常用S，s=S×10-13

s=————vω2x

v=沉降速度（dx/dt）ω=离心机转子角速度（弧度/s）

x=蛋白质界面中点与转子中心的距离（cm）2.SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法该法无须知道分子形状，实验室中应用更广泛。当样品加入到SDS—电泳缓冲液中后，形成的SDS—蛋白质，在含有SDS电泳系统中，蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量：

m为相对迁移率LogMr＝k1－bm先测得几种标准蛋白质的m，并以其分子量对数对m作图得一直线，再测出待测样品的m，查标准曲线即可确定分子量。对有亚基的蛋白质，如果用巯基乙醇拆开二硫键，测得的分子量为寡聚蛋白质的各个亚基的相对分子量。LogMrABCLogMr(样）m（样）m蛋白质作为机体的结构成分而存在，常见的蛋白质的生物机能：附注：肌肉的构成

骨骼肌以及很多非肌肉细胞含有两种形成特有的纤维状或丝状结构的蛋白质：肌球蛋白和肌动蛋白。按生物功能来说它们不是基本的结构蛋白质，它们参与需能的收缩活动。肌球蛋白是一种很长的捧状分子，有两条彼此缠绕的“—螺旋肽链的尾巴和一个复杂的“头”。它的总分子量为45