脱氮硫杆菌及其在水产养殖中的应用

脱氮硫杆菌及其在水产养殖中的应用摘要利用反硝化技术净化养殖水体污染的研究日益受到重视，而脱氮硫杆菌作为反硝化细菌的一个主要类群则越发被关注。该文在阐述养殖水体中亚硝酸盐和硫化物积累对养殖生态造成的影响以及脱氮硫杆菌的生长特性和自养反硝化原理的基础上，着重介绍了脱氮硫杆菌在分子生态学水平的应用研究进展，并对其在水产养殖上的应用进行了展望。关键词脱氮硫杆菌；自养反硝化；水产养殖；分子生态学养殖水体中的主要有害物质及控制亚硝酸盐氮在水体中以氮气、游离氨、离子铵、亚硝酸盐、硝酸盐和有机氮的形式存在。总氮和总磷一直被认为是引起水体富营养化的重要因子，而氨氮和亚硝酸盐氮是养殖过程中引起鱼类疾病的关键环境因子，尤其是亚硝酸盐浓度的超标（亚硝酸盐向硝酸盐转化不完全），是近年来鱼病发生的不可忽视的原因之一。养殖中发现，鱼类易患“棕血病”，这是因为亚硝酸通过鱼类鳃和体表进入到血液，与血红蛋白结合生成高铁血红蛋白，失去携氧能力，血液成棕色。作为强氧化剂，亚硝酸盐进入血液后扰乱氮排泄，降低氧合血红蛋白水平使各组织缺氧，低浓度时可使抵抗力下降，易患各种疾病［1］；我国淡水渔业用水标准规定，养殖水体中亚硝酸盐含量应控制在0.2mg/L以下，集约化养殖技术能够成功的关键就在于对水体中亚硝态氮的控制［2］。目前用生物降解转化法降低养殖水体亚硝酸盐含量是颇为有效的方法。硫化物养殖水体中，大量残饵、死藻、养殖生物排泄物等沉到水底增加了底部有机物含量，从而增加了硫化物的含量。硫化物作为重要污染物之一，同时也是监测养殖水环境的重要化学指标，对鱼虾类的生长危害较为严重，毒性很大。水体中硫化物包括溶解性的H2S、HS-、S2-，以及存在于悬浮物中的可溶性硫化物和酸可溶性金属硫化物［3］。硫化物可与养殖生物血液中的血红蛋白结合产生硫血红蛋白，降低了机体中血液的携氧能力。同时，硫化物对养殖生物的鳃组织具有很强的刺激和腐蚀作用，可使组织产生凝血性坏死，引起生物呼吸困难，血液、肾中硫代硫酸盐水平增加，大于2mg/L可致养殖生物死亡。故我国渔业水质标准中规定其在水质中含量不得超过0.2mg/L。管越强等［4］发现日本沼虾中超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活力随硫化物浓度的升高而增强，其免疫系统对硫化物有一定的耐受力，而当硫化物浓度过高时，沼虾的免疫能力降低，对机体抗氧化系统产生显著的影响。余静等［5］以过氧化物酶（POD）和酚氧化酶（PPO）作为指标，研究了硫化氢胁迫对罗氏沼虾的影响，结果发现POD和PPO酶在低浓度硫化氢处理下的活性显著提高，可能是对虾体内免疫系统应激反应的表现，当硫化氢浓度超过耐受范围后，细胞就会造成严重损伤，POD和PPO酶活力降低，这与管越强试验研究结果相似。养殖水体中主要有害物质的控制目前控制养殖水体中亚硝酸盐氮和硫化物的方法很多，水培植物（如浮床栽培空心菜［6］、凤眼莲、水花生、莴苣等）异养反硝化、自养反硝化、异养和自养相结合的方法等均有报导。不足的是水培植物的脱氮效率很低，谭洪新等［7］在研究水栽培蔬菜对养鱼废水的水质净化效果时发现，水培蔬菜对硝氮的去除率只有3.7%；吴伟等［8］通过在池塘水体中栽种以轮叶黑藻(Hydrillaverticillata)为主的水生植物，并添加活菌含量大于108g/L微生物制剂，构建了水生植物一微生物强化系统，研究该系统对日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)养殖水体的生物净化效果。研究表明，当水体中添加的微生物质量浓度为1.0mg/L时，适宜的水生植物覆盖率为40%，水生植物一微生物强化系统是一种良好的日本沼虾养殖水体生物净化系统。而水生植物与微生物相结合净化水体，效果虽然较为显著，但水生植物的栽培占面积较大，依然不是最理想的选择。故利用高效的具有反硝化脱硫功能的微生物净化养殖水质、控制亚硝酸盐和硫化物显得尤其重要。由于水产养殖需要保持充足的溶氧量，所以厌氧反硝化菌脱氮无法发挥正常的作用。具有一定溶氧量的养殖水体更有利于好养或兼性反硝化菌发挥作用。好养或兼性反硝化菌将硝酸盐和亚硝酸盐转化成气态氮，且可将氨在好氧条件下直接转化成气态产物。脱氮硫杆菌的性质和作用原理脱氮硫杆菌的生长特性1904年，Beijerinck首先分离得到脱氮硫杆菌(Thioba-cillusdenitrificans)，其属于硫杆菌属；具有代表性的硫杆菌属有排硫杆菌(Thiobacillusthioparus)、氧化硫杆菌(Thiobac-illusthiooxidans)、脱氮硫杆菌(Thiobacillusdenitrificans)和新型硫杆菌(Thiobacillusnovellus)。脱氮硫杆菌广泛存在于土壤、底泥、淡水和海洋沉积物、矿山排水、工厂、污水处理池和消化池；对温度和pH值的变化敏感，最适生长条件pH值为6.5〜8.0，最适温度28〜30°C。脱氮硫杆菌为革兰氏阴性化能自养细菌，电镜观察，菌细胞短杆状、单个、成对或短链状排列，具有单根极生鞭毛，无芽孢，菌体大小约为0.3〜0.8pmx0.8〜3.0pm。能在好氧和厌氧条件下以硫代硫酸盐和S2-作为能源、以CO2作为碳源进行生长，厌氧条件下可以硝酸盐作为电子受体还原为N2。该菌生长缓慢，无明显的稳定期且稳定期持续时间较短，随后进入衰亡期［9-10］。2.2脱氮硫杆菌反硝化原理脱氮硫杆菌能在好氧和厌氧条件下以硫代硫酸盐和S2-作为能源、以CO2作为碳源进行生长，厌氧(兼性厌氧)条件下可以硝酸盐作为电子受体还原为N2。正因为脱氮硫杆菌以二氧化碳为碳源，对鱼类有害的亚硝酸盐、硫化氢等均可被氧化为无毒的物质，同时减低了水体中的生物消耗量和化学耗氧量。其反硝化过程如下：脱氮硫杆菌胞内含1，5-二磷酸核酮糖羧化酶和5-磷酸核酮糖激酶，可通过卡尔文循环途径来固定CO2。脱氮硫杆菌以还原态硫作为电子供体，同时以硝酸盐作为电子受体，将其还原为N2,完成自养反硝化过程［11］。厌氧条件下，脱氮硫杆菌氧化硫的反硝化过程具体如下：S+0.4CO2+NO3-+0.76H2O+0.08NH4+—0.08C5H7O2N+0.5N2+1.1SO42-+1.28H+(1)0.844S2O32-+NO3-+0.347CO2+0.434H2O+0.086NH4++0.086HCO3-—0.086C5H7O2N+0.5N2+1.689SO42-+0.697H+(2)0.421H2S+0.421HS-+0.346CO2+0.086NH4++0.086HCO3-+NO3-—0.086C5H7O2N+0.5N2+0.842SO42-+0.434H2O+0.262H+(3)从NO3-还原到N2，经一系列连续的4步反应完成：NO3-—NO2-—NO—N2O—N2，分别由以下酶进行催化：硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、一氧化氮还原酶、一氧化二氮还原酶。通常细菌能否用于脱硫工艺的一个重要影响因素在于细菌产生的硫是积累在细胞内还是在细胞外。如果积累在细胞内，必然会产生大量的含硫细胞。这样硫的分离就比较困难，为此必须选择在细胞外形成硫的细菌，而脱氮硫杆菌即是具有这种特征的细菌。脱氮硫杆菌的优点：一是严格自养，不需要投放有机物作为碳源，节省开支，同时也不会引入额外的有机物，避免水体的二次污染；二是产生极少量的污泥，能将污泥处理量降低到最小［12］；三是不仅能在厌氧条件下生长，还可以利用硫化物。脱氮硫杆菌的应用研究鉴于脱氮硫杆菌具有脱氮和脱硫的特殊性质，近年来对脱氮硫杆菌的应用研究十分活跃。脱氮硫杆菌是典型的硫自养反硝化菌，有关研究主要集中在防腐应用、油田废水处理领域。作为微生物腐蚀的主要菌种之一的硫酸盐还原菌（SRB），脱氮硫杆菌能够与SRB共存，以氮源反硝化作用，抑制腐蚀性产物硫化物的产生，同时也在一定程度上抑制了SRB的生长，起到一定的防腐作用。汪梅芳等［13］利用静态挂片以及交流阻抗法（EIS）研究了脱氮硫杆菌对碳钢微生物的腐蚀影响，研究发现T.denitrificans的胞外高聚物增加了生物膜的致密性，阻碍了电荷传递过程，也降低了SRB的腐蚀。秦双等［14］将脱氮硫杆菌经培养活化后用于抑制老化油储油罐污水及油田废水中微生物腐蚀及脱除硫化物，发现加入TD生物制剂后，污水中FeS的去除率可达42.85%；污水中无机硫化物的总量去除率可达91.05%。脱氮硫杆菌的加入降低了污水中腐蚀性硫化物的含量，进而减缓油水界面层对基体材料的腐蚀破坏，同时降低界面附近SRB的生长及活性硫化物的产生，从而抑制了恶臭污染物硫化亚铁对环境的危害。近年来，利用脱氮硫杆菌来处理地下水和饮用水这一自养反硝化工艺也得到了广泛应用。Koenig等［15］在1997年进行了用脱氮硫杆菌处理垃圾填埋场渗滤污水，在填充不同粒径硫磺的固定床反应器系统来处理硝酸盐浓度高达400mg/L的污水，为以后高浓度硝酸盐污水处理提供了可行的依据。张承中等［16］利用脱氮硫杆菌接种至生物滴滤塔用于净化硫化氢气体浓度高达2000~3000mg/m3，对硫化氢的脱除率高达92%，为工业化应用中处理高浓度的硫化氢气体提供了依据。同时脱氮硫杆菌在矿体地下水以及矿体围岩地下水中活动性强，而在一般岩石或松散沉积物的地下水中活动较弱。因此，脱氮硫杆菌可以作为指示性微生物，作为矿化的直接指标。脱氮硫杆菌筛选驯化以及分子生态学水平上的研究因脱氮硫杆菌生长缓慢，对温度以及盐度的耐受性不强等限制了其应用，对于养殖水体而言，从养殖水体污泥中有效的筛选、培养和驯化脱氮硫杆菌，因温度、pH值等是脱氮硫杆菌生长的主要影响因素，因而可通过建立温度、pH值梯度进行稳定性驯化培养。采用添加特殊指示剂的培养基对脱氮硫杆菌也可以进行初步筛选，通过反硝化过程碱度变化，相应指示剂颜色变化，即可在筛选平板上出现特殊颜色的菌落。牛建敏等［17］从湖水、底泥、土壤、厌氧污泥等不同环境中采集菌种从培养、分离得到10种脱氮硫杆菌菌株，不同环境中脱氮硫杆菌在生理生化上存在差异，通过比较它们的硝酸盐氮去除速率，以期获得活性更强以及工程应用价值最大的菌株。同时，深入探讨脱氮硫杆菌的基因组学、蛋白组学技术，利用基因重组、基因改组等分子生物学技术构建高效基因工程菌，从而提高其生物脱氮的效率，是行之有效的方法。养殖水体单靠脱氮硫杆菌单一菌株想达到高效率的脱氮除硫效果，还是有很大困难的，如若将脱氮硫杆菌与其他具有不同净水功能的微生物菌株复合使用，根据治理对象的不同以及各种菌生理功能的差异，进行组合并采用多种工艺手段，以期达到治理大面积养殖水域的目的。目前，养殖水体中微生态制剂所涉及的微生物包括光合细菌、芽孢杆菌、硝化细菌、反硝化细菌等［18-20］。如养殖水体净化有关研究［21］，从富营养化的养殖水体中分离筛选得到具有不同生理功能的污染物治理菌株，如硫化细菌、硝化细菌、反硝化细菌、光合细菌、生物絮凝菌等，经优化配伍成性能优良的复合功能菌，因它们在生长过程中能产生的有用物质及分泌物质成为相互或各自的生长基质，形成一种共生增殖关系，从而达到有效净化养殖水体的目的。徐军祥等［22］首先从高盐高硫废水中活性污泥中获取脱氮硫杆菌，在不同浓度梯度下进行耐盐能力稳定性驯化培养，以获得耐盐脱氮硫杆菌，并与硝化菌混合培养形成复合菌剂，采用生物强化技术原理投加至废水。结果发现投加复合菌能加快COD降解速度，增强耐负荷冲击能力，提高COD、NH3-N和硫代硫酸盐(THS)的去除率。所谓的生物强化技术(bioaugmentation)即是为了提高原系统的废水处理能力，向原系统中投加从自然界中驯化筛选的优势菌种或通过基因重组技术产生的复合菌，以去除某一种或多种有害物质的方法。该技术自20世纪80年代以来被广泛研究。近年来，固定化微生物脱氮技术在养殖水质的控制上应用广泛，其优点包括在污废水脱氮治理中能够长期保持活性；可重复使用，节省投资；易于固液分离；有利于屏蔽或减少土著微生物、毒性物质及外界环境变化的干扰，可使含氮污水达到更好的修复效果［23］。因此，尝试将脱氮硫杆菌固定化投放到养殖废水中以便高效利用也是未来研究工作中所要努力的方向。也有研究将脱氮硫杆菌与形成絮凝体的异养细菌一起培养使脱氮硫杆菌得到固定化，从而形成性能良好的絮凝物以除去H2S。据统计，目前人们能够培养的微生物不足环境微生物总量的3%。近些年来，分子微生态学和现代生物化学的迅速发展推动着养殖水体微生物学的发展，人们逐渐通过分子生态学技术深入研究环境微生物如RLP技术用于研究环境微生物多样性；用DGGE技术研究反硝化微生物基因多样性，车轩等［24］PCR-DGGE技术从总DNA中扩增出目标16SrDNA片断，再对扩增的16SrDNA进行DGGE分析，对凝胶染色并进行条带统计分析和切胶测序，使用序列数据进行同源性分析并建立了系统发育树。其中，RT-PCR及实时荧光定量PCR技术研究环境反硝化微生物种群的定量研究。因为硫杆菌属种类较多，种间差异不大，因而用分子生物学手段对其进行分类鉴定，如运用16SrDNA分析来鉴定脱氮硫杆菌，是更具优势的也是较普遍的一种方法。脱氮硫杆菌作为氮素循环的重要微生物，其分子生态学上的研究不是很深入，因此提出了脱氮硫杆菌专一性PCR引物和探针，已经成为微生物生态学的迫切要求。赵阳国等［25］研究设计了脱氮硫杆菌在种级水平的专一性PCR引物/探针。脱氮硫杆菌专一性引物/探针的提出，将为不同生态环境中该种微生物的时空分布、结构动态以及实时定量等研究提供分子生物学工具。RobertS运用外源DNA探针从质粒库中分离出来2种转录脱氮硫杆菌1，5-二磷酸核酮糖的基因，并运用限制性酶分析2种基因的长度大小。此次研究也为脱氮硫杆菌在分子水平上的研究及应用奠定了一定的基础。脱氮硫杆菌在水产养殖中的应用前景与展望目前对自养反硝化菌脱氮硫杆菌的应用研究主要集中于饮用水、地下水、废水处理、防腐应用，而对养殖水处理的研究报道则较少。因循环水养殖系统具有节省空间、节约水资源、高产、高回报效益的优点的，作为我国水产养殖业现代化的支撑技术力量，该体系为工业化水产养殖提供了很好的技术模式。鉴于自养反硝化菌的诸多优点，有研究试着将脱氮硫杆菌运用到循环水养殖系统。自养反硝化过程会消耗一定的碱度，并且RAS系统水是循环使用的，所以长期下去可能有硫酸根的积累，而随着硫酸根浓度的升高反过来又会抑制脱氮速率。车轩[26]综述了在循环水养殖系统（RAS）中运用脱氮硫杆菌除硝酸盐的可行性，他提出将产生碱度的异养反硝化与自养反硝化进行集成，具有极大的潜力。将二者集成的脱氮方法具有两大优势：一方面碳源的消耗远远低于完全异养反硝化脱氮；另一方面使硫酸盐浓度得到有效控制。因此，在养殖水处理的实际应用中具有极强的可行性。有研究采用硫酸盐还原菌、脱氮硫杆菌和异养反硝化菌在生物滴滤塔中的填料表面进行挂膜，进行同步脱除SO2和NO试验，通过不同菌种的协同作用，SO2气体平均去除率达到了97.6%，而NO气体的平均去除率达到了51.4%。而Sora运用MSC（modifiedspentcaustic）即改良的废碱液投加到以硫为电子供体自养反硝化过程中去以补充消耗的碱度，使反硝化进程能持续的进行；同时SC的应用证实了污水脱氮的高效性，即COD/N的比值较低。若COD和TN含量过高的话，还要考虑到SC的添加剂量问题。小结自养反硝化技术对养殖水体净化的应用方面较小。有关耐盐、耐高低温的脱氮硫杆菌菌株的筛选驯化研究还需进一步加强，对脱氮硫杆菌尤其是分子水平的研究还不够深入。目前，硫自养反硝化技术还处于实验室研究及中试阶段，如果考虑将脱氮硫杆菌等反硝化细菌应用于河流、湖泊、鱼虾等养殖水体或自然水体中，