限制性内切酶小知识课件

限制性核酸内切酶

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限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease):识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。

[别名]Endodeoxyribonuclease

[酶反应]限制性内切酶能分裂DNA分子在一限定数目的专一部位上。它能识别外源DNA并将其降解。

[单位定义]在指明pH与37℃，在0.05mL反应混合物中，1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。定义和命名DNA限制性内切酶：

生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。限制性核酸内切酶的命名；一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株(品系)。例如，从BacillusamyloliquefaciensH中提取的限制性内切酶称为BamH，在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboI等。2.限制与修饰系统的种类

根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统主要分成三大类。表2-1是各种限制与修饰系统的比较。

Ⅱ型（typeⅡ）限制与修饰系统所占的比例最大，达93%。Ⅱ型酶相对来说最简单，它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割DNA，产生带3'-羟基和5'-磷酸基团的DNA产物，需Mg2+的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需SAM。识别序列主要为4-6bp，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列，切割位置因酶而异，有些是隔开的。

Ⅱs型（typeⅡs）限制与修饰系统，占5%，与Ⅱ型具有相似的辅因子要求，但识别位点是非对称，也是非间断的，长度为4-7bp，切割位点可能在识别位点一侧的20bp范围内。

Ⅱ型限制酶一般是同源二聚体（homodimer），由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成，每个亚单位作用在DNA链的两个互补位点上。修饰酶是单体，修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成，分别作用于其中一条链，但甲基化的碱基在两条链上是不同的。

在Ⅱ型限制酶中还有一类特殊的类型，该酶只切割双链DNA中的一条链，造成一个切口，这类限制酶也称切口酶（nickingenzyme），如N.BstNBI。

Ⅰ型（typeⅠ）限制与修饰系统的种类很少，只占1%，能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。如EcoK和EcoB。其限制酶和甲基化酶（即R亚基和M亚基）各作为一个亚基存在于酶分子中，另外还有负责识别DNA序列的S亚基，分别由hsdR、hsdM和hsdS基因编码，属于同一操纵子（转录单位）。EcoK编码基因的结构为R2M2S。EcoB编码基因的结构为R2M4S2。

EcoB酶的识别位点如下，其中两条链中的A为甲基化位点，N表示任意碱基。

TGA*（N）8TGCT

EcoK酶的识别位点如下，其中两条链中的A为可能的甲基化位点。

AA°C（N）6GTGC

但是EcoB酶和EcoK酶的切割位点在识别位点1000bp以外，且无特异性。

Ⅲ型（typeⅢ）限制与修饰系统的种类更少，所占比例不到1%，也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。它在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则是任意的，如EcoP1和EcoP15。它们的识别位点分别是AGACC和CAGCAG，切割位点则在下游24-26bp处。

在基因操作中，一般所说的限制酶或修饰酶，除非特指，均指Ⅱ型系统中的种类。

表2-1：各种限制与修饰系统的比较ⅡⅠⅢ酶分子内切酶与甲基化酶分子不在一起三亚基双功能酶二亚基双功能酶识别位点

4-6bp,大多数为回文对称结构二分非对称

5-7bp非对称切割位点在识别位点中或靠近识别位点无特异性，至少在识别位点外1000bp在识别位点下游24-26bp

限制反应与甲基化反应分开的反应互斥

同时竞争限制作用是否需用ATPNoYes

Yes

2．限制酶识别序列的结构

限制酶识别的序列大多数为回文对称结构，切割位点在DNA两条链相对称的位置。EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列和切割位置如下：

EcoRⅠG↓AATTC；HindⅢA↓AGCTT

CTTAA↑GTTCGA↑A

有一些限制酶的识别序列不是对称的，如AccBSⅠ[CCGCTC（-3/-3）]和BssSⅠ[CTCGTG（-5/-1）]。识别序列后面括号内的数字表示在两条链上的切割位置。

AccBSⅠCCG↓CTC；BssSⅠC↓TCGTG

GGC↑GAGGAGCA↑C

有一些限制酶可识别多种序列，如AccⅠ识别的序列是GT↓MKAC，也就是说可识别4种序列，其中两种是对称的，另两种是非对称的。HindⅡ识别的序列是GTY↓RAC。有一些限制酶识别的序列呈间断对称，对称序列之间含有若干个任意碱基。如AlwNⅠ和DdeⅠ，它们的识别序列如下：

AlwNⅠCAGNNNC↓TG；DdeⅠC↓TNAG

GT↑CNNNGACGANT↑C

3．限制酶切割的位置限制酶对DNA的切割位置大多数在内部，但也有在外部的。在外部的，又有两端、两侧和单侧之别。切点在两端的有Sau3AⅠ（↓GATC）、NlaⅢ（CATG↓）和EcoRⅡ（↓CCWGG）等；在两侧的有BcgⅠ[（10/12）CGA（N）6TGC（12/10）]和TspRⅠ（CASTGNN↓），BcgⅠ酶的切割特性与其它酶不同，它们在识别位点的两端各切开一个断点，而不是只产生一个断点。切点在识别位点外侧的还有BbvⅠ[GCAGC（8/12）]和BspMⅠ[ACCTGC（4/8）]等。

BcgⅠ↓10（N）CGA（N）6TGC（N）12↓；↑12（N）CGA（N）6ACG（N）10↑TspRⅠNNCAC（G）TGNN↓↑NNGTG（C）ACNN3．限制酶产生非对称突出端许多限制酶切割DNA产生非对称突出端。当识别序列为非对称序列时，切割的DNA产物的末端是不同的，如BbvCⅠ，它的识别切割位点如下：

CC↓TCAGC

GGAGT↑CG有些限制酶识别简并序列，其识别的序列中有几种是非对称的。如AccⅠ，它的识别切割位点如下，其中GTAGAC和GTCTAC为非对称：

GT↓AT/CGAC

CATA/GC↑TG有些限制酶识别间隔序列，间隔区域的序列是任意的，如DraⅢ和EarⅠ，它们的识别切割位点分别是CAC↑NNN↓GTG和CTCTTC（1/4）。4．同裂酶（isoschizomer）识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。具体可分为以下几种情况。①同序同切酶这些酶识别序列和切割位置都相同，如HindⅡ与HincⅡ识别切割位点为GTY↓RAC，HpaⅡ与HapⅡ识别切割位点为C↓CGG，MobⅠ与Sau3AⅠ识别切割位点为↓GATC。②同序异切酶KpnⅠ和Acc65Ⅰ识别的序列是相同的，但它们的切割位点不同，分别为GGTAC↓C和G↓GTACC。另外，Asp718Ⅰ识别和切割位点为G↓GTACC。③“同功多位”许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。如EcoRⅠ识别和切割位点为G↓AATTC，ApoⅠ识别和切割位点为R↓AATTY，后者可识别前者的序列。另外，HpaⅠ和HincⅡ的识别位点也有交叉，它们的识别和切割位点分别为GTT↓AAC和HincⅡ。④其它有些限制酶识别的序列有交叉，如在pUC系列质粒的多克隆位点中有一个SalⅠ位点（识别切割位点为G↓TCGAC），该位点也可被AccⅠ（识别切割位点为GT↓MKAC）和HincⅡ（识别切割位点为GTY↓RAC）切割。5．同尾酶许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相同的，且是对称的，即它们可产生相同的粘性突出末端。这些酶统称为同尾酶。这些酶切割DNA得到的产物可进行粘端连接。以下几种酶产生的末端是相同的。通过表4-3很容易判断哪些酶可产生相同的DNA末端。·EcoRⅠ

G↓AATCCMfeⅠ

C↓AATTCApoⅠR↓AATTY·SpeⅠA↓CTAGTNheⅠG↓CTAGCXbaⅠT↓CTAGA·BamHⅠG↓GATCCSau3AⅠ↓GATCStyⅠC↓CWWGG·ClaⅠAT↓CGATAccⅠGT↓MKAC（pUC19）常见同尾酶总结如下（来自网络）6．识别特殊系列的Ⅰ-prefix和pⅠ-prefix系列酶有些线粒体、叶绿体、核DNA、T偶数噬菌体含有一些编码内切酶的内含子，有些intein（proteinsplicingelement）也有内切酶的活性，这两类内切核酸酶称为Ⅰ-prefix和pⅠ-prefix系列内切酶，它们识别的序列很长。Ⅰ-prefix是由在RNA水平上剪切和编码的，pⅠ-prefix在蛋白质水平上剪切的产物。这类内切酶也称为homingendonuclease，目前商业化的种类有6种。从因特网上可以找到Intein的数据库Inbase（InteinDatabase），该网站由NewEnglandBioLabs公司维护（）。Ⅰ-CeuI酶是衣滴虫（Chlamydomonaseugametos）叶绿体大rRNA基因的内含子编码的产物，识别位点为26bp，识别的核心部位为-12至+7位置的19bp。反应温度为37℃，识别位点如下，方框内为核心识别序列。TAACTATAACGGTC↑CTAA↓GGCA表2-3：靠近DNA片段末端的切割效率%（用寡核苷酸检测）影响酶活性的因素

影响酶切活性的因素有许多，概略的说可分为外因和内因。外因是可预见和控制的，如反应条件、