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文档简介
本文格式为Word版,下载可任意编辑——木聚糖酶和CMC活力的测定方法
木聚糖酶活力的测定方法
1.方法:3,5—二硝基水杨酸比色法,简称DNS法。2.原理:
还原糖能将3,5—二硝基水杨酸分子中的硝基还原成橙黄色的3—胺基5—硝基水杨酸。溶液橙黄色强度与还原糖量成正比。3.主要仪器和设备
天平(感量1mg和0.1mg两种),离心机,恒温水浴锅,磁力搅拌器,分光光度计(722型,符合GB9721的有关规定)。4.试剂和溶液
4.1所用水除特别要求外,均为符合GB/6682—1992规定的三级水,化学药品除特别要求外,均为分析纯。4.2DNS试剂
称取3,5—二硝基水杨酸10g参与500ml水中,分屡屡参与氢氧化钠16g,搅拌溶解(温度<45℃),再分屡屡参与酒石酸钾钠300g,搅拌至全溶,冷却后用水定容至1000ml。室温下棕色瓶储存暗处放置,一周后使用(如有沉淀过滤后使用)。
4.30.1mol/L,pH5.0醋酸—醋酸钠缓冲液
吸取冰醋酸1.8ml,加适量水,加醋酸钠5.78g,溶解,定容至1000ml,调理PH至5.00±0.01后使用。室温下存放2个月有效。4.40.1%即1mg/ml木糖标准溶液
无水木糖于80℃烘至恒重,称取0.1000g于烧杯中,加适量水溶解,转入容量瓶中并定容至100ml。4.51.0%木聚糖溶液
称取木聚糖1.00g于烧杯中,用2ml0.5mol/L氢氧化钠润湿成糊状,加40ml缓冲液,于60~70℃水浴中加热溶解,冷凉后用0.5mol/L醋酸(约2ml)调pH5.0,转入容量瓶中,加缓冲液(4.3)定容至100ml。假使冰箱中放置时间长了出现沉淀,使用前应在热水浴中热溶。4.6木糖标准曲线的绘制
吸取1mg/ml木糖溶液0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml于试管中,补水至2ml,加DNS试剂3ml,混合后于沸水中煮10min,冷却后定容至15ml,于分光光度计540nm波长下测吸光度(A)。以吸光度为纵坐标,木糖量为横坐标,绘制标准曲线,三次重复试验的均值用最小二乘法拟合一元线性方程y=ax﹢b,求出吸光度与木糖量的关系。5.待测酶样品的处理
5.1液体酶:直接吸取酶液做适当稀释,使测定光吸收值在0.25—0.4范围内。5.2液体曲:离心上清液做适当稀释,使测定光吸收值在0.25—0.4范围内。5.3固体曲:按干重计称取4g于三角瓶中,加水200ml,室温下磁力搅拌浸提
0.5h。取离心上清液做适当稀释。
5.4固体粉状酶:称取适量于烧杯中(确切至0.0001g),用少量水润湿并调成糊状,再用水溶解,离心上清液做适当稀释。5.5固体粒状酶:研磨成粉后如5.3处理。6.酶活力测定
取15ml具塞刻度试管按下面的反应顺序进行操作,在反应过程中,从参与底物(吸取前摇匀)(4.5)开始,向每支试管中参与试剂的时间间隔要绝对一致,50℃水解10min.
反应步骤及试剂、溶液用量见下表:试样1.加底物(4.5)1.8ml2.50℃预热3min3.加酶液0.2ml4.混合5.50℃水解10min6.加DNS试剂3ml7.混合8.沸水浴中10min9.冷却定容至15ml10.空白调零540nm下测定2.50℃预热3min3.50℃水解10min4.加DNS试剂3ml5.混合6.加酶液0.2ml7.混合8.沸水浴中10min9.冷却定容至15ml10.空白调零540nm下测定空白1.加底物(4.5)1.8ml
7.酶活力单位计算
酶活力=(S×D×1000)/(0.2×10)×1.7μg/ml(g).min式中:
S—测得光吸收在标准曲线上对应的木糖量,mg数;D—酶液或酶粉稀释倍数;
1000—mg和μg之间的换算系数;0.2—测定所取酶液量,ml数;10—反应时间,min数;1.7—方法换算系数。
8.酶活力单位定义及换算
8.1本方法酶活定义:在本测定条件下,每分钟水解木聚糖产生1μg还原糖(以木糖计)所需酶量定义为一个酶活力单位(u)。
国际酶活单位的定义:在测定条件下,每分钟水解木聚糖产生1μmol还原糖(以木糖计)所需酶量定义为一个酶活力单位(IU)。8.2u与国际单位IU的换算关系:
1u=1÷150IU(μmol糖/ml(g).min)
150:木糖的分子量
内切纤维素酶(CMC酶)活力的测定方法
1.方法:3,5—二硝基水杨酸比色法,简称DNS法。2.原理:
还原糖能将3,5—二硝基水杨酸分子中的硝基还原成橙黄色的3,5—硝基水杨酸。溶液橙黄色强度与还原糖量成正比。3.主要仪器和设备
天平(感量1mg和0.1mg两种),离心机,恒温水浴锅,磁力搅拌器,分光光度计(722型,符合GB9721的有关规定)。4.试剂和溶液
4.1所用水除特别要求外,均为符合GB/6682—1992规定的三级水,化学药品除特别要求外,均为分析纯。4.2DNS试剂
称取3,5—二硝基水杨酸10g参与500ml水中,分屡屡参与氢氧化钠16g,搅拌溶解(温度<45℃),再分屡屡参与酒石酸钾钠300g,搅拌至全溶,冷却后用水定容至1000ml。室温下棕色瓶储存暗处放置,一周后使用(如有沉淀过滤后使用)。
3.30.1mol/L,pH4.80醋酸—醋酸钠缓冲液
吸取冰醋酸2.4ml,加适量水,加醋酸钠4.92g,溶解,定容至1000ml,调理PH至4.80±0.01后使用。室温下存放2个月有效。3.40.1%即1mg/ml葡萄糖标准溶液
无水葡萄糖于80℃烘至恒重,称取0.1000g于烧杯中,加适量水溶解,转入容量瓶中并定容至100ml。
3.51.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液
称取CMC-Na1.50g于烧杯中,加适量缓冲液置于水浴中加热(<50℃)溶解成胶状,转入容量瓶中并用缓冲液(4.3)定容至100ml,置冰箱中备用。3.6葡萄糖标准曲线的绘制
吸取1mg/ml无水葡萄糖溶液0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml于试管中,补水至2ml,加DNS试剂3ml,混合后于沸水中煮10min,冷却后定容至15ml,于分光光度计540nm波长下测吸光度(A)。以吸光度为纵坐标,葡萄糖量为横坐标,绘制标准曲线,三次重复试验的均值用最小二乘法拟合一元线性方程y=ax﹢b,求出吸光度与葡萄糖量的关系。4待测酶样品的处理
5.1液体酶:直接吸取酶液做适当稀释,使测定光吸收值在0.25—0.4范围内。
5.2液体曲:离心上清液做适当稀释,使测定光吸收值在0.25—0.4范围内。5.3固体曲:按干重计称取4g于三角瓶中,加水200ml,室温下磁力搅拌浸提0.5h。取离心上清液做适当稀释。
5.4固体粉状酶:称取适量于烧杯中(确切至0.0001g),用少量水润湿并调成糊状,再用水溶解,离心上清液做适当稀释。5.5固体粒状酶:研磨成粉后如5.3处理。6酶活力测定
取15ml具塞刻度试管按下面的反应顺序进行操作,在反应过程中,从参与底物(吸取前摇匀)(4.5)开始,向每支试管中参与试剂的时间间隔要绝对一致,50℃水解30min.
反应步骤及试剂、溶液用量见下表:试样1.加底物(4.5)1.8ml2.50℃预热3min3.加酶液0.2ml4.混合5.50℃水解30min6.加DNS试剂3ml7.混合8.沸水浴中10min9.冷却定容至15ml10.空白调零540nm下测定空白1.加底物(4.5)1.8ml2.50℃预热3min3.50℃水解30min4.加DNS试剂3ml5.混合6.加酶液0.2ml7.混合8.沸水浴中10min9.冷却定容至15ml10.空白调零540nm下测定7酶活力单位计算
酶活力=(S×D×1000)/(0.2×30)÷1.5μg/ml(g).min式中:
S—测得光吸收在标准曲线上对应的葡萄糖量,mg数;D—酶液或酶粉稀释倍数;1000—mg和μg之间的换算系数;0.2—测定所取酶液量,ml数;30—反应时间,min数;1.5—方法换算系数。
8酶活力单位定义及换算
8.1本方法酶活定义:在本测定条件下,每分钟水解
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