iCycler iQ荧光实时多波长PCR检测系统操作说明

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iCycleriQTM荧光实时多波长PCR检测系统

操作说明

iCycleriQTMMulti-ColorRealTimePCRDetectionSystem

OperatingInstructions

CatalogNumber

170-8740

如与英文版说明书有不符之处以英文版说明书为准

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2．iCycleriQTM荧光实时多波长PCR检测系统操作速成

2.1简介：

iCycleriQTM荧光实时多波长PCR检测系统可以最多一次检测96个样品，且每个样品中同时可以检测4个不同波长的荧光信号。也就是说，只要标记不同荧光探针，iCycler可以对同一个孔中两种以上的PCR产物（最多四种）同时进行实时分析。这样对多重PCR反应或使用内对照（InternalControl）定量的PCR反应的检测就十分便利。

在反应过程中，不同的荧光信号通过与其匹配的不同波长的滤光镜组来检测。譬如，在一个反应管中同时有四种荧光探针共存，分别标记了FAM、HEX、TexasRed?和CyTM5，在收集其荧光信号数据的时候，必需同时使用FAM滤光镜组、HEX滤光镜组、TexasRed滤光镜组和Cy5滤光镜组。所有的收集的信号由iCycler的软件进行分析整理，在PCR反应终止后，该软件可以显示其各自的荧光曲线和标准曲线，并得到这四种荧光探针分别对应的靶DNA的定量结果。

在每次使用iCycler进行PCR荧光定量试验之前，系统必需获得孔间差异因子（WellFactor）和纯染料校准（PureDyeCalibration）的数据。系统通过这些数据来区分不同的荧光信号，矫正孔间的误差。本章节将详细的介绍这两者的调理方法。您在使用本仪器前请先细心阅读本章的内容，这将有助于您能够快速地完成试验并获得理想的试验数据。

2.2：iCycler操作速成

1.开机前先让摄象系统预热30分钟。接通iCycler的电源，并连上电脑，开启iCycler的软件。假使本仪器在上次使用后被搬动过，请在RunTimeCentral模块中的ImagingService窗口检查遮光框的校正状况，详见6.2。

2.假使要使用新的荧光染料/滤光镜组，必需进行一次纯染料校准（PureDyeCalibration），使系统获得相关数据，详见2.4。

3.在96孔薄壁反应板（96-wellThinWallplate，产品序列号223-9441）内参与PCR反应试剂和待测样本。完成后在反应板上盖一块光学级封带（OpticalQualitysealingtape，产品序列号223-9444），用封带涂抹器（塑料扁平齿）

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将其涂抹光滑。注意，无论带不带手套，都不要让手指接触到封带表面。完成后撕去封条四周的白条。假使不用96孔薄壁PCR反应板，而是用单独的PCR反应管或八连管时，请在加完样品后盖上相匹配的盖子。注意，为防止放入iCycler的PCR反应管被压碎，在使用绿色抗凝环（greenanticondensationring）时至少放8个反应管；假使没有使用该环，则至少要加14个反应管。4.在ProtocolWorkshop模块中设置PCR热循环的程序（thermalprotocol），包括温度、时间、循环次数等参数的设置。详见5.1。

5.在ProtocolWorkshop模块中设置反应板设置文件（PlateSetup）。先创立一个新的反应板设置文件，再根据本次试验的所用的荧光染料选择其对应的滤光镜设置文件（FliterWheelSetupfile），详见5.2.5。最终，在设置窗口的96孔模拟布局图中选择本次试验使用哪些孔、样品类型（sampletype）以及要检测的荧光基团种类。假使样品类型是标准品的话，还要输入其对应的量。全部完成后再点击“ViewPlateSetup〞键，进行确认。详见5.2。6.确认上一步中选择的滤光镜组是否就位。详见5.2.5。

7.假使试验需要使用孔间差异矫正板（externalwellfactorplate）进行系统孔间差异矫正的，先将该板放入iCycler；假使是使用反应板内部矫正的，直接将步骤3中准备好的PCR反应板放入iCycler。详见2.3。在ProtocolLibrary模块中“ViewProtocol〞窗口选择PCR热循环文件；同样在该模块的“ViewPlateSetup〞窗口选择反应板设置文件。完成后按“Run〞键。

8.随后系统自动切换到“RunPrep〞窗口，用户在此确认PCR热循环文件和反应板设置文件是否正确。在“Samplevolumeis〞文件框中输入反应体系的体积；根据本次试验内容在“IdentifyProtocolAnalysis〞中选择是PCR定量/熔点曲线（PCRQuantification/MeltCurve）还是纯染料校准（PureDyeCalibration）；在“WellFactorSource〞中选择系统孔间差异矫正是使用孔间差异矫正板（WellFactorPlate）还是使用反应板内部矫正（ExperimentalPlate）。一切都完成后点击“BeginRun〞键（见图2.1）。9.给本次的数据记录文件（opd文件）起名。

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10.假使是使用反应板内部矫正的，系统会在PCR反应前自动收集孔间差异因子的数据；假使使用了孔间差异矫正板，则系统会先用大约5分钟时间收集孔间差异因子数据，然后自动进入暂停模式（PauseMode）。取出孔间差异矫正板，将步骤3中准备好的PCR反应板放入iCycler中，盖好。点击“ContinueRunningProtocol〞（见图2.6）。

11.PCR循环开始后，系统会开启Run-TimeCentral模块对试验进行实时监控。当试验进行到荧光收集循环时，DataAnalysis模块会自动开启，进行数据的收集和分析。

2.3：孔间差异因子（WellFactor）

在采用荧光实时法对PCR反应进行检测的过程中，反应管之间的差异对结果的确凿性有一定的影响，这就是所谓的孔间差异因子（WellFactor）。为了获得更科学更真实的结果，iCycler在PCR反应开始前必需获得孔间差异因子的数据，以便于对每个反应管中荧光信号强度进行矫正。一般矫正孔间差异因子的方法有两种，一是用孔间差异矫正板（WellFactorPlate），二是反应板内部矫正。

相较而言，在这两种方法中，采用反应板内部矫正是较简单较科学的方法。这种方法得到的矫正数据也叫动力学孔间差异矫正因子。使用这个方法的前提是在每个反应管中必需含有一致浓度同种成分的荧光基团。譬如，在一块反应板的

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每个反应管中都参与50nM荧光素，100nmHEX，125nMTexasRed和200nMCy5，就可以使用反应板内部矫正。但假使某管中和其他管成分不同，譬如某管中荧光素含量为100nM或200nM的话，这种方法就不可行了。如采用反应板内部矫正，在“RunPrep〞窗口的“WellFactorSourse〞选项框中选择“ExperimentalPlate〞选项即可（见图2.1）。系统软件会在PCR反应前自动收集孔间差异因子的数据。

假使在试验中采用如SYBRGreenI或溴乙啶等能与DNA结合的荧光染料，那么上述方法就无效了。由于在PCR反应的靶DNA预变性过程中，这样的荧光信号强度比较弱，统计所得的孔间差异因子的数据偏差较大。解决这个问题的方法有两种，一是采用孔间差异矫正板；二是在PCR主反应液中参与微量的荧光素稀释液（详见2.3.2）。参与这种稀释液后，在95oC下SYBRGreenI等的荧光信号强度会增加，这样用反应板内部矫正也能得到较确凿的孔间差异因子的数据。

2.3.1：孔间差异因子数据来源（WellFactorSource）：反应板内部矫正（ExperimentalPlate）

假使使用反应板内部矫正的话，荧光探针必需没有二级结构（在纯染料校准时也必需解开二级结构），所以必需在PCR反应板第一次被加热到90oC以上的

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时候系统才会开始收集荧光信号，并得到孔间差异因子的数据。

2.3.2：使用反应板内部矫正来进行孔间差异因子矫正操作指南

假使选择使用反应板内部矫正，系统软件会在用户设定的PCR热循环文件开始前先插入执行一个名为“Dynaicwf.tmo〞的文件，95oC加热90秒。这样用户在设置PCR热循环文件的时候就要考虑到这一点，在预变性段中要减去相应的时间。譬如，您本来的设定是95oC预变性10分钟，这一来您就要改成95oC预变性8.5分钟。

在执行这个插入文件的过程中，被选定的滤光镜组会进入工作位置，系统软件开始收集各反应管中的荧光信号，统计孔间差异因子。当这些完成后，系统软件的Run-timeCentral界面中会跳出提醒信息（见图2.3）。

假使用SYBRGreenI，那么我们建议调理PCR主反应液的荧光染料终浓度为10nM。先将1mM的荧光素校准染料（FluoresceinCalibrationDye，产品序列号170-8780）用PCR缓冲液（10mMTris，pH8.0，50mMKCl，3mMMgCl2）稀释1000倍，配成1μM的稀释液。然后依照稀释液：PCR主反应液=1：99的比例进行配制，譬如10μl1μM稀释液加990μlPCR主反应液，这样就能得到荧光素终浓度为10nM的PCR主反应液。

在反应板内部矫正完成后，系统软件会将其数据储存在本次试验的数据记录（opd文件）中，然后自动开始执行设定的PCR热循环文件。

2.3.3：孔间差异因子数据来源（WellFactorSource）：孔间差异矫正板（WellFactorPlate）

当一次试验中各反应管中所含的荧光基团的种类和含量不同，譬如某反应

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管含有200nM荧光素而其他反应管只含100nM，或者某反应管用的是TexasRed而其他都用荧光素。象这样的状况下，孔间差异因子只能用孔间差异矫正板来矫正。

所谓的孔间差异矫正板，就是一块和本次试验一样的PCR反应板，其反应管与试验用PCR反应板的反应管顺序一一对应。在孔间差异矫正板上，每个反应孔中含有和对应的试验用PCR反应板的反应管中相等体积的溶液以及一致种类和浓度的荧光基团。譬如本次试验用PCR反应板的A1反应管内PCR反应液的总体积是50μl，100nM荧光素，那么孔间差异矫正板的A1反应管也加50μl液体，100nM荧光素。假使您一个反应管中含有不止一种荧光基团，那么我们建议您在孔间差异差异矫正板上使用我们伯乐公司的孔间差异矫正板稀释液（ExternalWellFactorPlateSolution，产品序列号170-8794），当然只有一种荧光基团也可以使用本产品。

2.3.4：制备孔间差异矫正板

本公司提供的孔间差异矫正板稀释液是10×的，使用前先用ddH2O稀释10倍。然后在孔间差异矫正板的反应管中参与与其对应试验用PCR反应板反应管内PCR反应液一致体积的1×孔间差异矫正板稀释液和同样成分的荧光基团。譬如试验用PCR反应板A5反应管内有50μlPCR反应液，100nM荧光素，那么孔间差异矫正板的A5反应管同样要参与50μl1×孔间差异矫正板稀释液（内含荧光素100nM）。

加样完毕后，在板上盖一块清白的光学级封带。将板略微离心一下，使各反应管管壁上没有液体残留，全部流到反应管底部。

您可以在Run-TimeCentral模块的ImagingService窗口确认准备好的孔间差异矫正板中每管的荧光信号遮光框有没有调理好，CCD照相机像素有没有饱和（详见6.2）。

2.3.5：使用孔间差异矫正板来进行孔间差异因子矫正操作指南

在一块PCR反应板上进行不同的试验项目或纯染料校准时只能使用本法矫正孔间差异因子。

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将准备好的孔间差异矫正板放入iCycler，盖上热盖。

在ProtocolLibrary模块中选择PCR热循环程序和反应板设置文件，然后点击“Run〞。

在“RunPrep〞界面中的“WellFactorSource〞选项框中选择“WellFactorPlate〞选项。其他选项一致。完成后点击“BeginRun〞。

此时系统软件会在用户设定的PCR热循环文件开始前先插入执行一个名为“External.tmo〞的文件，长度为3分钟（见图2.4）。内容为：（95oC10秒60oC30秒）×260oC1分钟

在此期间系统会收集孔间差异因子数据，Run-TimeCentral模块会显示相应信息（见图2.5）。

系统在孔间差异因子收集完毕后，会进入暂停模式，此时取出孔间差异矫正板，放入试验用PCR反应板，盖好热盖，点击“ContinueRunningProtocol〞（见图2.6）。

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2.4：纯染料校准（PureDyeCalibration）和RME文件（RMEFiles）

任何一种荧光染料，第一次在iCycler上使用前，都必需进行一次纯染料校准。当然假使更换滤光镜组，也是如此。一种荧光染料/滤光镜组组合在同一台iCycler只需要进行一次纯染料校准（前提是相应的滤光镜组不被更换），其数据会被系统保存，以后试验中可以读取。

纯染料校准的功能，其实就是使系统在收集信号的时候能确凿鉴别某一种荧光信号。它的操作方法很简单，就是把相应的荧光染料校准溶液（每种荧光染料有其相应的荧光染料校准溶液）参与反应板的各反应管中，然后放入iCycler，设置、运行一个PCR热循环文件，所得到的校准数据被系统保存在C:\\ProgramFiles\\Bio-Rad\\iCycler\\Ini文件夹的REM.ini文件中。

一次纯染料校准可以同时测定16种不同荧光染料/滤光镜组组合（一次至多含4种不同荧光染料）。测定完成后，系统自动将数据存入RME文件。一旦一种荧光染料/滤光镜组组合在一台iCycler上进行过纯染料校准，那在以后在这台iCycler的试验中假使使用到这种组合就可以读取其数据。只要您进行一次纯染料校准，RME文件就会被更新一次。假使同种组合再校准一次，那么新的校准数据会覆盖原来的校准数据。

假使一次试验中使用没有进行过纯染料校准的荧光染料/滤光镜组组合时，那么系统会提出警告。此时必需对这种组合进行一次纯染料校准以更新RME文件。为了以防万一（譬如系统崩溃），您可以在C:\\ProgramFiles\\Bio-Rad\\iCycler\\Ini文件夹中找到RME文件并将其改名备份在硬盘的其他区域或软盘中。

2.4.1：纯染料校准RME文件例举

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由于单种荧光染料可以通过多种滤光镜组检测到，譬如TexasRed就可以通过490/530、530/575、548/595、575/620、635/680等滤光镜组检测。系统必需通过RME文件的记录来鉴别通过某滤光镜组收集的荧光信号是对应什么荧光染料的信号。所以整个RME文件分为大量小文件段。每个文件段对应每种荧光染料在不同的滤光镜组下的校准数据。

以下是一个荧光染料组合的纯染料校准数据RME存档的例子。使用的荧光染料为FAM-490和Cy5-635。[FAM-490]

490/20X_!_530/30M=5.384598e+003635/30X_!_680/30M=1.565864e+001[CY5-635]

490/20X_!_530/30M=2.951601e+001635/30X_!_680/30M=6.064747e+003

假设再对另外的一种荧光染料组合FAM-490和TexasRed575进行一次纯染料校准，则RME文件将被更新为：[FAM-490]

490/20X_!_530/30M=5.332098e+003635/30X_!_680/30M=1.565864e+001575/30X_!_620/30M=3.864038+001[TexasRed-575]

490/20X_!_530/30M=1.40998e+001575/30X_!_620/30M=4.737024e+004

[CY5-635]

490/20X_!_530/30M=2.951601e+001635/30X_!_680/30M=6.064747e+003

经过其次次校准后，您可以注意到文件中FAM-490对于490/530滤光镜组的校准数值略有改变，增加了FAM-490对于575/620滤光镜组的校准值和Texas

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Red-575对于两种滤光镜组的校准值，这是由于其次次校准后RME文件更新造成的；而FAM-490和Cy5-635对于635/680滤光镜组的数据没有改动，这是由于其次次校准没有测试相关数据。

上述其次份REM文件适合于使用FAM-490&TexasRed–575组合和FAM-490&Cy5-635组合以及三种荧光染料单独使用的试验。但当使用TexasRed–575&Cy5-635组合时就不行。由于该文件没有TexasRed–575对于635/680滤光镜组的校准值和Cy5-635对于575/620滤光镜组的校准值。此时只能进行第三次纯染料校准，得到第三份RME文件：[FAM-490]

490/20X_!_530/30M=5.632098e+003–未变635/30X_!_680/30M=1.565864e+001–未变575/30X_!_620/30M=3.864038+001–未变[TexasRed-575]

490/20X_!_530/30M=1.40998e+001–未变575/30X_!_620/30M=4.81645e+004–更新635/30X_!_680/30M=2.64573e+000–新值[CY5-635]

490/20X_!_530/30M=2.951601e+001–未变635/30X_!_680/30M=6.123537e+003–更新575/30X_!_620/30M=4.746395e+001–新值

经过第三次纯染料校准后，这三种荧光染料对应三组滤光镜组的任意组合都可以使用了。当然，您可以在一次纯染料校准中同时将其全部完成。

2.4.2：制备纯染料校准反应板（PureDyeCalibrationPlate）

制备纯染料校准板必需使用本公司提供的荧光染料校准溶液（PureDyeCalibrationSolution，产品序列号170-8792）。每种荧光染料都有其对应的荧光染料校准溶液。该溶液中含有相应荧光标记的寡核苷酸，其浓度都已经调配到最正确工作状态，所以注意，千万不要对其稀释。若一次对多种荧光染料（最多4种）

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进行校准，那么在纯染料校准反应板上加样的时候，必需将其对应的校准溶液分开加到不同反应管中。纯染料校准反应板制备的具体操作步骤如下：

将第一种荧光染料校准溶液在反应板上加10个反应管，每孔50μl。若有其他荧光染料则同上操作，至多再加3次（注意要加在未加过样的反应管中）。

加完样后在板上盖一块清白的光学级封带，将反应板略微离心一下，使反应管壁上没有液体残留，全部流到反应管底部。

由于反应板各反应孔中所含荧光染料种类不同，所以必需用孔间差异矫正板来矫正孔间差异因子，具体操作见2.3.4。

对于SYBRGreenI我们建议您准备用500pg/μl的DNA溶液稀释100,000倍的SYBRGreenI的校准液；对于溴乙非啶我们建议你准备同样DNA终浓度为500pg/μl，溴乙非啶终浓度为1μg/ml的校准液。

2.4.2：纯染料校准上机操作

设置一个PCR热循环文件，内容为：55oC1分钟55oC1分钟×10

在软件界面上选择在循环的其次步（55oC，1分钟，10个循环）进行实时检测（显示黄色照相机状图标）（见图2.7）。

设置反应板设置文件。在模拟96孔模拟图上选择各反应管中所含的荧光染料的种类。如图2.8，B2-B11反应管中加了荧光素校准溶液；D2-D11反应管中

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加了TexasRed校准溶液；H2-H11中加了Cy5校准溶液。

把孔间差异矫正板放入iCycler，在ProtocoLibrary模块中选择方才设置的PCR热循环文件和反应板设置文件，点击“Run〞。

在“RunPrep〞的界面中，输入反应体系的体积，在“IdentifyProtocolAnalysis〞选项框中选择“PureDyeCalibration〞。注意，一旦选择该选项，则在“WellFactorSourse〞选项框中“ExperimentalPlate〞选项就会变灰而成为不可选选项（见图2.9）。

点击“BeginRun〞。

给本次数据记录文件起名。此时系统开始收集孔间差异因子数据，详见2.3。其数据收集完毕后，系统自动进入暂停模式。取出孔间差异矫正板，放入纯染料校准反应板，点击“ContinueRunningProtocol〞。此时系统开始正式进行纯染料校准数据收集，完成后，系统界面会有提醒信息跳出（见图2.10）。

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2.5：1.440（1.0）版文件的转换

2.5.1：数据记录（DataFile）

只要在C:\\ProgramFiles\\Bio-Rad\\iCycler\\Ini文件中保存有REM.ini文件并在该文件中有FAM/SYBR的记录，1.440以后各版本的软件都可开启在1.440版软件下保存的试验数据记录。FAM/SYBR记录的正确格式如下：[FAM/SYBR]

485DF22_!_535RDF45=4.021013e+003

在软件版本更新时，系统会自动将RME文件存在原先的位置。

在2.1880以后的版本中，系统会自动将RME的数据保存到opd文件中，所以你可以把你的数据拷贝到另外的一台电脑上进行分析。假使你在2.1.880版中开启一个1.440版的数据记录，再保存。那么此时系统中的RME数据也将被写入该数据记录。

注意：假使当前的RME.ini文件中没有FAM/SYBR的记录，1.440版的数据记录将不能被开启。当然，上述在2.1.880版中开启再保存一个1.440数据记录来写入RME文件的方法也失效。

2.5.2：PCR热循环文件（Thermalprotocols）

1.440版中设置的PCR热循环文件通用于以后所有版本的软件。

2.5.3：反应板设置文件（PlateSetups）

1.440版的反应板设置文件不能和以后的版本通用。您不能在1.440版以后版本软件中开启或是修改1.440版中设置的反应板设置文件，但可以在其中浏览它的内容，也可以将其打印下来，这样可以很便利地重新设置这些文件。假使您在新版本软件中使用1.440版的反应板设置文件，系统会提醒您该文件需要升级

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（见图2.11）。

2.6：1.880（2.0）版文件的转换

1.880版的文件通用于以后所有版本软件。

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3．iCycler系统软件简介

3.1：iCycler软件界面的构成

iCycler的软件界面分为5个功能模块，分别是“ProtocolLibrary〞模块、“ProtocolWorkshop〞模块、“RunTimeCentral〞模块、“UserProfile〞模块和“DataAnalysis〞模块。通过这些模块，用户可以很便利使用iCycler进行各项试验。如图3.1，这是“ProtocolLibrary〞模块的“ViewProtocol〞窗口，其功能是管理已保存的PCR热循环文件。iCycler的系统将PCR热循环文件储存成带有“tmo〞后缀的文件，详见5.1。同样，“ViewPlateSetup〞窗口是管理已保存的反应板设置文件。反应板设置文件被系统保存成带有“pts〞后缀的文件，详见5.2。在iCycler软件界面中，各模块的选择切换键始终在界面的最左边，用户可以很便利地选择切换。

3.1.1：ProtocolLibrary模块

ProtocolLibrary是对已保存的PCR热循环文件、反应板设置文件、试验数据记录进行管理的模块。用户可以在其中实现以下功能：

浏览已保存的PCR热循环文件浏览已保存的反应板设置程序文件

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浏览反应板设置文件中各反应管的标识和对应的模板量（标准品）。将数据记录切换到DataAnalysis模块中进行分析。

将已保存的PCR热循环文件切换到ProtocolWorkshop模块中进行修改。将已保存的反应板设置程序文件切换到ProtocolWorkshop模块中进行修改。以已保存的PCR热循环文件和反应板设置文件开始一次试验。

当用户要设置新的PCR热循环文件或反应板设置程序文件时进行简要说明。

3.1.2：ProtocolWorkshop模块

ProtocolWorkship是设置PCR热循环文件和反应板设置文件的模块。用户可以在其中实现以下功能：

修改已保存的PCR热循环文件修改已保存的反应板设置文件新建PCR热循环文件并将其保存新建反应板设置文件并将其保存

以新建的PCR热循环文件和反应板设置文件开始一次试验。

当一次试验中新建的PCR热循环文件和反应板设置文件分别保存后，用户以后可以根据实际需要和原有文件重新排列组合使用。

3.1.3：Run-TimeCentral模块

试验时当用户在ProtocolWorkshop模块的“RunPrep〞窗口中确认完反应的各项设置后，系统自动转到RunTimeCentral模块。该模块实际上就是用来实时监测反应的各项参数，包括反应开始时间、预计终止时间、实时温度变化曲线等。

3.1.4：DataAnalysis模块

有两种进入DataAnalysis模块的方法：

一是在试验中，当系统开始收集试验数据时，Run-TimeCentral模块就会自动开启DataAnalysis模块；

二是您可以在ProtocolLibrary模块中开启一个试验数据记录，系统会自动

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切换到DataAnalysis模块。

在该模块中用户可以实现以下功能：浏览试验数据记录优化数据记录

设置样品的临界循环数（thresholdcycle，即Ct值）建立标准曲线

确定未知样品的初始模板量对试验数据进行统计分析。

3.1.5：UserProfile模块

该模块独立于其他的4个模块。在该模块中，用户可以对PCR热循环的一些内部默认参数进行设置，还可以得到选择转轮上各滤光镜的位置信息（在该模块中不能对滤光镜进行设置，详见5.2.5）。

3.2：iCyclerPCR热循环内部参数

在iCycler中一个PCR热循环文件可以最多包含9种不同的循环，每种循环最多可以有9个步骤。在步骤设置中，至少要设置保持温度（SetpointTemperature）和保持时间（DwellingTime）；在循环设置中，除了其各步骤设置外，至少还要设置其循环次数。

3.2.1：保持温度和时间调控范围

iCyclerPCR热循环的温控范围是4.0—100.0oC，保持时间的调控范围是1秒到99分钟59秒（99:59）。

假使某步骤保持时间设置为0秒，那么iCycler会先将温度调理到该步骤设置的温度，然后立刻执行下一个步骤。

假使用户想长时间保持在某一温度又不能决定确凿保持时间，那么您可以使用永久保温选项（InfiniteHoldoption）进入永久保温模式。一旦某个步骤被设置成该模式，则系统会一直保持该步骤设定的温度直到人为地终止该程序。假使被设置成永久保温模式的步骤并不是PCR热循环文件的最终一步，那么在执行该

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步骤的时候系统会自动切换成暂停模式（PauseMode）并一直保持该步骤设定的温度。此时用户可以点击“ContinueRunningProtocol〞键，系统就会执行后面的程序。

3.2.2：高级选项

以下是PCR设置文件的高级选项。其具体运用详见5.1.4。

RampRate&RampTime：RampRate指的是执行PCR热循环文件时的加热/冷却速度，而RampTime指的是相连两个步骤之间的间隔时间，其实也就是两个步骤之间的加热/冷却时间。iCycler的默认设置是RampRate最大，RampTime最短，也就是加热/冷却速度最快，间隔时间最短。用户可以根据需要修改RampRate或RampTime。但一个表格中只能选择一种方法来调整。RampRate以0.1oC/秒为最小计量单位，加热时可调范围是0.1－3.3oC/秒，冷却时可调范围是0.1－2.0oC/秒。RampTime的最小计量单位是0.1oC。

自动增加/降低保持时间或温度（AutomaticIncrement/DecrementofTemperatureorDwellingTimeSetpoint）：我们可以举个例子说明这个设置的作用。譬如PCR热循环文件有一个步骤是55oC，30秒。而通过这个设置，用户可以使这个步骤每过一个循环温度上升（或下降）0.1oC，保持时间每过一个循环上升（或下降）1秒。这样就为下降式PCR（TD-PCR）等有此类特别要求的PCR反应提供了便利。温度改变的最小计量单位是0.1oC/循环。保持时间改变的最小计量单位是0.1秒/循环。

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4．ProtocolLibrary模块

在ProtocolLibrary模块中，用户可以浏览已保存的PCR热循环文件、反应板设置文件、数据记录等。在该模块中也有修改、运行PCR热循环文件和反应板设置文件的选项。一旦用户选择了这些选项，系统会自动切换到ProtocolWorkshop模块，详见第5章。

在ProtocolLibrary窗口顶端，有四个窗口切换选择键，点击它们可进入不同的窗口。这些窗口分别是：

ViewProtocols：管理已保存的PCR热循环文件（tmo文件），详见4.1。ViewPlateSetup：管理已保存的反应板设置文件（pts文件），详见4.2。ViewQuantitiesandIdentifiers：显示选定反应板设置文件的详细信息，详见4.3。

ViewPost-RunData：管理试验数据记录，详见4.4。

4.1ViewProtocls

当用户切换到ProtocolLibrary模块时，系统默认自动进入“ViewProtocol〞窗口（见图4.1）。当然，用户也可以点击界面上端的“ViewProtocol〞窗口选择切换键进入。

如图4.1，您可以看到有关于PCR热循环文件的文件框、表格、图表占了这个窗口面积的2/3强。靠近窗口下端的曲线图中，横坐标（X轴）代表反应温度，纵坐标（Y轴）代表反应时间。该曲线图主要显示以下信息：

曲线图顶端的抬头框中显示各循环的循环次数（如图4.1中，40x代表循环40次）；

抬头框下面显示各步骤的保持温度（对应曲线X轴）和保持时间（对应曲线Y轴）；

某个步骤下面有个照相机形状图标代表系统在该步骤收集荧光信号（如图4.1中，55oC，0:30下方）。灰色的照相机图标表示收集的数据用于已有数据记录的分析；黄色的照相机图标表示对这次本试验进行实时分析；绿色的照相机图标表示收集熔点曲线数据。

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假使想在PCR反应中使用自动增加/降低保持时间或温度功能（AutomaticIncrement/DecrementofTemperatureorDwellingTimeSetpoint），见5.1.4。

该窗口上部5个文件框分别显示以下信息：

左上的文件框可选择目标PCR热循环文件所在的驱动器，如图4.1所示，该目标PCR热循环文件存储在C盘；

左下的文件框用来选定目标PCR热循环文件的存储路径（必需在上面文件框选定的驱动器中），如图4.1所示，该目标PCR热循环文件存储路径为C:\\ProgramFiles\\Bio-Rad\\iCycle\\User1\\；

上述两个文件框右边的一个文件框（ProtocolFiles）显示所有选定路径下所有的PCR热循环文件（tmo文件），并对其进行选择；

右上的文件框（ViewingProtocol）显示当前的PCR热循环文件名；右下的文件框（Owner’sID）显示创立当前PCR热循环文件用户的登录名。窗口最右侧有4个键，他们从上到下分别是：

Edit：点击该键，系统自动切换到ProtocolWorkshop模块的“EditProtocol〞窗口对当前PCR热循环文件进行修改，详见5.1；

Custom：点击该键，系统自动切换到ProtocolWorkshop模块的“EditProtocol〞窗口，用户可以新建一个PCR热循环文件，详见5.1；

Run：点击该键，系统自动切换到ProtocolWorkshop模块的“RunPrep〞窗口，用户可以以当前的PCR文件（协同“ViewPlateSetup〞中选定的反应板设

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置文件）进行试验，详见5.4；

Print：打印窗口下端记录当前PCR热循环文件内容的表格。

4.2ViewPlateSetup

在ProtocolLibrary模块窗口上端点击“ViewPlateSetup〞窗口切换选择项便可进入该窗口。其界面分布与“ViewProtocol〞窗口相像，最大的不同的在于该窗口下端是96孔反应板模拟布局图，而不是曲线图（见图4.2）。

该窗口上部6个文件框分别显示以下信息：

左上的文件框可选择目标反应板设置文件所在的驱动器，如图4.2所示，该目标反应设置文件存储在C盘；

左下的文件框用来选定目标反应板设置文件的存储路径（必需在上面文件框选定的驱动器中），如图4.2所示，该目标反应板设置文件存储路径为C:\\ProgramFiles\\Bio-Rad\\iCycle\\User1\\；

上述两个文件框右边的一个文件框（PlateSetupFiles）显示所有选定路径下所有的反应板设置文件文件（pts文件），并对其进行选择；

右上的文件框（ViewingOpticalPlate）显示当前的反应板设置文件名；右中的文件框（Owner’sID）显示创立当前反应板设置文件用户的登录名；右下的文件框（FilterWheelSetup）显示当前反应板设置文件对应的滤光镜

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组设置文件名。

窗口最右侧有4个键，他们从上向下分别是：

Edit：点击该键，系统自动切换到ProtocolWorkshop模块的“EditPlateSetup〞窗口对选定反应板设置文件进行修改，详见5.2；

Custom：点击该键，系统自动切换到ProtocolWorkshop模块的“EditPlateSetup〞窗口，用户可以新建一个反应板设置文件，详见5.2；

Run：点击该键，系统自动切换到ProtocolWorkshop模块的“RunPrep〞窗口，用户可以以当前的反应板设置文件（协同“ViewProtocol〞中选定的PCR热循环文件）进行试验，详见5.4；

Print：打印窗口中当前反应板设置文件的96孔模拟布局图。窗口右下的两个文件框从上到下分别是：

QuantityUnits：显示选定反应板设置文件中标准品的计量单位。其单位可以是拷贝数（copynumber）、微摩尔（micromole）、纳摩尔（nanomole）、皮摩尔（picomole）、法摩尔（fetomole）、诶摩尔（attomole）、毫克（milligram）、微克（microgram）、纳克（nanogram）、皮克(picogram)、法克（fetogram）、诶克（attogram）；

FluorophoresDefined：显示各种荧光染料对应的不同颜色的蜡笔图标。在96孔模拟布局图上方有三个选项，用来选择在布局图上显示选定反应板设置文件的不同设置信息，从左到右分别是：

Samples：这是系统默认的选项，显示用于反应的反应管的位置以及样品类型（标准品、未知样品、空白、对照、纯染料等）；

Fluos：显示各反应管中使用的荧光染料种类，每种荧光染料由右侧“FluorophoresDefined〞文件框中规定的颜色来表示。所有不用检测的反应管用灰色表示（见图4.3）；

Notes：显示选定反应板设置文件的创立者对该文件的说明（见图4.4）。

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4.3ViewQuantitiesandIdentifiers

显示当前反应板设置文件各孔的详细设置信息（见图4.5）

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4.4ViewPost-RunData

在ViewPost-RunData窗口中，用户可以浏览所有已保存的数据记录（opd文件）。

该窗口上部5个文件框分别显示以下信息：

左上的文件框可选择目标数据记录所在的驱动器，如图4.6所示，该数据记录存储在D盘；

左下的文件框用来选定目标数据记录的存储路径（必需在上面文件框选定的

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驱动器中），如图4.6所示，该数据记录存储路径为D:\\customerdata\\；

中间的一个文件框显示所有选定路径下所有的数据记录（opd文件），并对其进行选择；

右上的文件框（ProtocolUsedinRun）显示选定的数据记录在试验中使用的PCR热循环文件；

右下的文件框（PlateSetupUsedinRun）显示选定的数据记录在试验中使用的反应板设置文件。

该窗口左下部4个文件框分别显示以下信息：

DataAnalysisFileName：显示选定的数据记录的名称；

FilterWheelSetupUsedinRun：显示选定数据记录在试验中使用的滤光镜组设置文件；

UseExternalCalibrationfile：在该框中打钩表示选定数据记录在试验中使用孔间差异矫正板来矫正孔间差异因子；不打钩则表示使用的是反应板内部矫正；

DataRunNotes：显示用户对该试验记录的说明。该窗口右下部2个选项的用途如下：

AnalysisData：假使选定数据记录用于荧光定量或熔点曲线分析，则点击该选项，系统会自动切换到DataAnalysis模块进行分析；

Calibration：假使选定数据用于纯染料校准，则点击该选项，系统会自动切换到DataAnalysis模块进行分析。

注意：假使用户选择“Calibration〞选项，系统会根据选定纯染料校准数据记录对现存的RME文件进行更新。假使用户想保有原有的RME文件，请在开启纯染料校准文件之前将RME文件备份。

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5．ProtocolWorkshop模块

在ProtocolWorkshop模块中，用户可以新建、修改PCR热循环文件、反应板设置文件。在ProtocolWorkshop有4个窗口，他们分别是：

EditProtocol：新建和修改PCR热循环文件，详见5.1；EditPlateSetup：新建和修改反应板设置文件，详见5.2；

Quantities/Identifiers：显示反应板设置文件的详细信息，详见5.3；RunPrep：试验进行前对选定的PCR热循环文件、反应板设置文件等进行确认，详见5.4。

5.1EditProtocol

这个窗口是进入ProtocolWorkshop模块时系统默认的显示窗口。在该窗口中，用户可以新建PCR热循环文件，也可以对已有的PCR文件进行修改。

如图5.1，在该界面上部大约占整个窗口面积1/3的是PCR热循环文件的温度—时间曲线图。横坐标代表保持时间（X轴），纵坐标代表保持温度（Y轴）。而窗口的最下方是显示PCR热循环文件内容的表格。窗口中部的各文件框和功能键从左到右分别是：

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ChangeProtocolFilename：显示PCR热循环文件的名称，并可以对其进行修改；

Owner：显示创立该PCR热循环文件的用户的登录名；ProtocolOption：PCR热循环文件的高级选项框；Save：保存对当前PCR热循环文件的修改；

Run：以当前PCR热循环文件进行一次试验（协同EditPlateSetup窗口中选定反应板设置文件）；

OpticalDataColletion：确定在哪些步骤中进行荧光信号收集。

在本节中，5.1.1和5.1.2介绍如何新建和修改PCR热循环文件；5.1.3介绍PCR热循环文件的曲线图；5.1.4介绍PCR热循环文件的高级选项；5.1.5介绍在PCR热循环文件中如何插入、删除循环或步骤，5.1.6介绍荧光信号收集步骤的确定；5.1.7介绍PCR热循环文件的保存。

5.1.1新建PCR热循环文件操作速成

1．在ProtocolLibrary模块中，选择ViewProtocol窗口；

2．点击Custom键，系统会自动切换到ProtocolWorkshop模块的EditProtocol

窗口；

3．在该窗口下端的表格中设置PCR热循环文件。这个表格和窗口上部的曲

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线图是相互对应的，一旦表格中的内容发生了变动，在曲线图中也会发生相应变化。对于新建一个PCR热循环文件，系统会先提供一个系统默认的PCR热循环文件，让用户根据需要对其进行修改双击表格中需要修改的单元格，然后根据需要输入对应参数。

假使要在某个循环前插入一个循环，先点击表格上方“Cycle〞字样下的“Insert〞键，然后点击表格中该循环的任何区域；假使要在最终一个循环后插一个循环，同样点击“Cycle〞字样下的“Insert〞键，然后点击表格最终一个循环下面第一排空行的任意区域。一个PCR热循环文件最多能有9个循环。假使您把光标移到“Insert〞键上并右击鼠标，会跳出选项让您选择是插入循环中的步骤是一步、两步还是三步，用户可以根据实际状况选择。

假使要删除某个循环，先点击表格上方“Cycle〞字样下的“Delete〞键，然后点击表格中需删除循环的任何区域。

假使要在一个循环中的某个步骤前插入一个步骤，先点击表格上方“Step〞字样下的“Insert〞键，然后点击表格中该步骤的任何区域。一个循环最多可以有9个步骤。假使您把光标移到“Insert〞键上并右击鼠标，会跳出选项让您选择是在选定步骤的前面还是后面插入，用户可以根据实际状况选择。

假使要删除某个步骤，先点击表格上方靠左“Step〞字样下的“Delete〞键，然后点击表格中需删除步骤的任何区域。

4．假使用户想在PCR热循环文件中参与高级选项，只需在ProtocolOption

选项框中在对应选项前打钩即可。

假使您选择了永久保温选项（InfiniteHold），系统会在窗口下方的表格中自动加出一列，表头为“Hold〞。假使某个步骤要永久保温，在表格中该步骤的“Hold〞选项中打钩即可。

假使您选择了熔点曲线选项（MeltCurve），系统会在窗口下方的表格中自动加出三列。表头为“MeltCurve〞的一列是用来选择哪个步骤来收集熔点曲线数据，同时，在“OpticalDataCollection〞选项框中该步骤会显示绿色照相机图标。表头为“+Temp〞和“-Temp〞的两列，则是启动了

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自动增加保持温度选项（IncrementTemperature）和自动降低保持温度选项（DecrementTemperaure）。举例来说，假使您在某个循环中某个步骤的“+Temp〞中输入0.5，那么在执行该循环过程中，每循环一次，该步骤的保持温度会增加0.5oC；同样，假使您在某个循环中某个步骤的“-Temp〞中输入0.5，那么在执行该循环过程中，每循环一次，该步骤的保持温度会降低0.5oC。

假使您选择了自动增加保持温度选项（IncrementTemperature）或自动降低保持温度选项（DecrementTemperaure）时，系统会在窗口下方的表格中自动加出三列。“+Temp〞和“-Temp〞的功能如上文所述，表头为“BeginRepeat〞的那列表示开始执行自动增加\\降低保持温度开始的循环次数，表头为“Howoften〞那列表示循环几次执行一次自动加温/降温。譬如在某个循环的某个步骤的“+Temp〞格中输入0.5，在“BeginRepeat〞格中输入3，在“Howoften〞格中输入2，那就表示在该循环执行到第三次后，每过2次循环，该步骤的保持温度会增加0.5oC。

假使您选择了自动增加保持时间选项（IncrementTime）或自动降低保持时间选项（DecrementTime），类似于自动增加/降低保持温度选项，系统也会在窗口下方的表格中自动加出三列。表头为“BeginRepeat〞和“Howoften〞两列的功能如上文所述，表头为“+Time〞和“-Time〞的两列也类似于“+Temp〞和“-Temp〞，假使您在表格中某个循环的某个步骤的“+Time〞格中输入00:05，则在执行该循环过程中，每循环一次，该步骤的保持时间会增加5秒；假使您在表格中某个循环的某个步骤的“-Time〞格中输入00:05，则在执行该循环过程中，每循环一次，该步骤的保持时间会减少5秒。

假使您选择加热/冷却速度选项（Ramping），系统会在窗口下方的表格中自动加出一列，表头为“RampRate〞。用户可以对每两个相邻步骤间的加热/冷却速度进行调整。

假使您选择循环名称选项（CyclerName），系统会在窗口下方的表格中自动加出一列，表头为“CyclerDesript.〞，用户可以对每个循环进行简要的说明；假使您选择步骤说明选项（StepProcess），系统会在窗口下方的

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表格中自动加出一列，表头为“Process〞，用户可以对每个步骤进行简要的说明。

5．在OpticalDataCollection文件框中选择在哪些步骤进行荧光信号收集。

在某步骤前的小方块中点击一下，会出现一个灰色的照相机图标，代表该步骤收集的数据用于原有数据记录的分析；

在某步骤前的小方块中点击两下，会出现一个黄色的照相机图标，代表该步骤收集的数据用于本次试验的实时分析；

假使在某步骤前的小方块中点击两下后再点击一下，照相机图标会消失，同时也取消了在该步骤的信号收集任务。

6．双击ChangeProtocolFilename文件框，输入PCR热循环文件的文件名。7．点击“Save〞键，会出现一个对话框，再次点击“Save〞键，保存该PCR

热循环文件。

您可以将PCR热循环文件和反应板设置文件保存在iCycler文件夹或其任何子目录中。

5.1.2修改PCR热循环文件操作速成

1．在ProtocolLibrary模块中，选择ViewProtocol窗口；

2．在该窗口左上的文件框中选择目标PCR热循环文件所在的驱动器；3．在下面的文件框中选择目标PCR热循环文件的保存路径；4．在ProtocolFiles文件框中选择目标PCR热循环文件的文件名；5．点击“Edit〞键，系统会自动切换到ProtocolWorkshop模块的EditProtocol

窗口；

6．在该窗口下部的表格中设置PCR热循环文件。这个表格和窗口上部的曲

线图是相互对应的，一旦表格中的内容发生了变动，在曲线图中也会发生相应变化。双击表格中需要修改的单元格，然后根据需要输入对应参数。

假使要在某个循环前插入一个循环，先点击表格上方“Cycle〞字样下的“Insert〞键，然后点击表格中该循环的任何区域；假使要在最终一个循环后插一个循环，同样点击“Cycle〞字样下的“Insert〞键，然后点击

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表格最终一个循环下面第一排空行的任意区域。一个PCR热循环文件最多能有9个不同循环。假使您把光标移到“Insert〞键上并右击鼠标，会跳出选项让您选择是插入循环中的步骤是一步、两步还是三步，用户可以根据实际状况选择。

假使要删除某个循环，先点击表格上方“Cycle〞字样下的“Delete〞键，然后点击表格中需删除循环的任何区域。

假使要在一个循环中的某个步骤前插入一个步骤，先点击表格上方“Step〞字样下的“Insert〞键，然后点击表格中该步骤的任何区域。一个循环最多可以有9个步骤。假使您把光标移到“Insert〞键上并右击鼠标，会跳出选项让您选择是在选定步骤的前面还是后面插入，用户可以根据实际状况选择。

假使要删除某个步骤，先点击表格上方靠左“Step〞字样下的“Delete〞键，然后点击表格中需删除步骤的任何区域。

7．果用户想在PCR热循环文件中参与高级选项，只需在ProtocolOption选

项框中在对应选项前打钩即可。

假使您选择了永久保温选项（InfiniteHold），系统会在窗口下方的表格中自动加出一列，表头为“Hold〞。假使某个步骤要永久保温，在表格中该步骤的“Hold〞选项中打钩即可。

假使您选择了熔点曲线选项（MeltCurve），系统会在窗口下方的表格中自动加出三列。表头为“MeltCurve〞的一列是用来选择哪个步骤来收集熔点曲线数据，同时，在“OpticalDataCollection〞文件框中该步骤会出现绿色照相机图标。表头为“+Temp〞和“-Temp〞的两列，则是启动了自动增加保持温度选项（IncrementTemperature）和自动降低保持温度选项（DecrementTemperaure）。举例来说，假使您在某个循环中某个步骤的“+Temp〞中输入0.5，那么在执行该循环过程中，每过循环一次，该步骤的保持温度会增加0.5oC；同样，假使您在某个循环中某个步骤的“-Temp〞中输入0.5，那么在执行该循环过程中，每过循环一次，该步骤的保持温度会降低0.5oC。

假使您选择了自动增加保持温度选项（IncrementTemperature）或自动降

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低保持温度选项（DecrementTemperaure）时，系统会在窗口下方的表格中自动加出三列。“+Temp〞和“-Temp〞的功能如上文所述，表头为“BeginRepeat〞的那列表示开始执行自动增加\\降低保持温度开始的循环次数，表头为“Howoften〞那列表示循环几次执行一次自动加温/降温。譬如在某个循环的某个步骤的“+Temp〞格中输入0.5，在“BeginRepeat〞格中输入3，在“Howoften〞格中输入2，那就表示在该循环执行到第三次后，每过2次循环，该步骤的保持温度会增加0.5oC。

假使您选择了自动增加保持时间选项（IncrementTime）或自动降低保持时间选项（DecrementTime），类似于自动增加/降低保持温度选项，系统也会在窗口下方的表格中自动加出三列。表头为“BeginRepeat〞和“Howoften〞两列的功能如上文所述，表头为“+Time〞和“-Time〞的两列也类似于“+Temp〞和“-Temp〞，假使您在表格中某个循环的某个步骤的“+Time〞格中输入00:05，则在执行该循环过程中，每循环一次，该步骤的保持时间会增加5秒；假使您在表格中某个循环的某个步骤的“-Time〞格中输入00:05，则在执行该循环过程中，每循环一次，该步骤的保持时间会减少5秒。

假使您选择加热/冷却速度选项（Ramping），系统会在窗口下方的表格中自动加出一列，表头为“RampRate〞。用户可以对每两个相邻步骤间的加热/冷却速度进行调整。

假使您选择循环名称选项（CyclerName），系统会在窗口下方的表格中自动加出一列，表头为“CyclerDesript.〞，用户可以对每个循环进行简要的说明；假使您选择步骤说明选项（StepProcess），系统会在窗口下方的表格中自动加出一列，表头为“Process〞，用户可以对每个步骤进行简要的说明。

8．OpticalDataCollection文件框中选择在哪些步骤进行荧光信号收集。

在某步骤前的小方块中点击一下，会出现一个灰色的照相机图标，代表该步骤收集的数据用于以前数据记录的分析；

在某步骤前的小方块中点击两下，会出现一个黄色的照相机图标，代表该步骤收集的数据用于本次试验的实时分析；

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假使在某步骤前的小方块中点击两下后再点击一下，照相机图标会消失，同时也取消了在该步骤的信号收集任务。

9．点击“Save〞键，可以保存对该PCR热循环文件的修改；10．

假使用户想对该文件重新命名，双击ChangerProtocolFilename文件

框，然后输入新的文件名称。

您可以将PCR热循环文件和反应板设置文件保存在iCycler文件夹或其任何子目录中。

5.1.3：PCR热循环曲线图

EditProtocol窗口上方的曲线图使PCR热循环文件的设置变得十分形象化（见图5.2）。曲线图上部的抬头框里的数字代表正下方曲线代表的循环在文件中的序号。抬头框下面标明白各步骤的保持温度和保持时间，当然有时由于空间有限，部分步骤的保持温度和时间无法在此处标注。

假使用户想放大或是缩小代表时间的X轴，按住键盘上的“Ctrl〞键，同时把光标放在X轴上，按住鼠标左键进行左右拖曳。往左拖曳缩小，往右拖曳放大。松开鼠标左键，操作完成。

假使某个步骤为指定为进行荧光收集的步骤，则在曲线图中代表该步骤的曲线上方会出现一个照相机图标。灰色的代表数据用于以前试验记录分析，黄色的代表数据用于本次试验的实时分析。

把光标放在曲线图的任意处右击鼠标，会出现两个新的选项：

CopyGraph：用户可以复制曲线并把它粘贴到其他PCR热循环文件中；PrintGraphy：用户可以将曲线图打印出来。

5.1.4：PCR热循环文件表格和高级选项

EditProtocol窗口下部的表格显示了PCR热循环文件的具体内容和各项设置（见图5.1）。其表头分别代表以下意义：

Cycle：代表循环在PCR热循环文件中执行先后次序的序号。一个PCR热循环文件最多有9个循环；

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Repeats：代表一个循环的循环次数。一个循环最多循环600次。假使一个循环里的步骤不只一个，那其循环次数只显示在表格中该循环的第一行；

Step：代表一个循环中步骤的序号。一个循环最多有9个步骤；

Dwelltime：代表一个步骤的保持时间。其调理范围是1秒（00:01）到99分钟59秒（99:59）；

Setpoint：代表一个步骤的保持温度。其调理范围是4.0oC到100.0oC。以上的内容是每个PCR热循环文件都会出现的。还有些内容必需在ProtocolOption文件框中选择对应选项才会出现。其具体内容见以下表格。

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ProtocolOption选项PCR热循环文件表格抬头

选项功能及说明

InfiniteHold

MeltCurve

IncrementTemperature

Hold

CheckBox

+Temp

-Temp

+Temp

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选择该选项，用户可以启动永久保温功能。

一旦在ProtocolOption中选择了“InfiniteHold〞，表格会多出抬头为“Hold〞的一列。在表格中某个步骤的该选项中打钩，就代表该步骤为永久保温模式。

选择该选项，用户可以得到样品的熔点曲线。

一旦在ProtocolOption中选择“MeltCurve〞选项，表格会多出三列。抬头为“CheckBox〞的那一列来选择哪个步骤进行熔点曲线数据收集。

抬头为“+Temp〞的一列为开启自动增加保持温度功能（一般熔点曲线要使用这个功能）。抬头为“-Temp〞的一列为开启自动降低保持温度功能（一般熔点曲线要使用这个功能）。选择该选项，用户可以启动自动增加保持温度功能。该功能能使某个步骤的保持温度随着循环次数的增加而增加。一旦在ProtocolOption中选择了“IncrementTemperature〞选项，表格会多出三列。其中表头为“+Temp〞的一列代表每次增加多少温度；“BeginRepeat〞的那一列说明自动升温开始的循环次数；“HowOften〞代表每循环几次升一次温。譬如从某个循环的第2次循环开始，其第2个步骤每循环3次增加1o

C，那么在该步骤的“+Temp〞中输入1，在“BeginRepeat〞中输入2，在“HowOften〞中输入3。

ProtocolOption选项PCR热循环文件表格抬头

选项功能及说明

DecrementTemperature

IncrementTime

-Temp

+Time

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选择该选项，用户可以启动自动降低保持温度功能。该功能能使某个步骤的保持温度随着循环次数的增加而降低。一旦在ProtocolOption中选择了“DecrementTemperature〞选项，表格会多出三列。其中表头为“-Temp〞的一列代表每次降低多少的温度；“BeginRepeat〞的那一列说明自动降温开始的循环次数；“Howoften〞代表每循环几次降一次温。譬如从某个循环的第2次循环开始，其第2个步骤每循环3次降低1oC，那么在该步骤的“-Temp〞中输入1，在“BeginRepeat〞中输入2，在“HowOften〞中输入3。选择该选项，用户可以启动自动增加保持时间功能。该功能能使某个步骤的保持时间随着循环次数的增加而增加。一旦在ProtocolOption中选择了“IncrementTime〞选项，那么该表格会多出三列。其中表头为“+Time〞的一列代表每次增加多少时间；“BeginRepeat〞的那一列说明自动加时开始的循环次数；“Howoften〞代表每循环几次加一次时。譬如从某个循环的第2次循环开始，其第2个步骤每循环3次增加5秒，那么在该步骤的“+Time〞中输入00:05，在“BeginRepeat〞中输入2，在“HowOften〞中输入3。

ProtocolOption选项PCR热循环文件表格抬头

选项功能及说明

DecrementTime

Ramping

-Time

RampRate

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选择该选项，用户可以启动自动减少保持时间功能。该功能能使某个步骤的保持时间随着循环次数的增加而减少。一旦在ProtocolOption中选择了“DecrementTime〞选项，那么该表格会多出三列。其中表头为“-Time〞的一列代表每次减少多少时间；“BeginRepeat〞的那一列说明自动减时开始的循环次数；“Howoften〞代表每循环几次减一次时。譬如从某个循环的第2次循环开始，其第2个步骤每循环3次减少5秒，那么在该步骤的“-Time〞中输入00:05，在“BeginRepeat〞中输入2，在“HowOften〞中输入3。

该选项可以让用户设置相邻两个步骤之间的加热/冷却速度。用户可以选择是指定加热/冷却速度还加热/冷却时间。一旦用户选择该选项，表格中会多出表头为“RampRate〞的一列。表格上方也多出一个选项框，其中“RampRateindeg/sec〞的选项代表指定加热/冷却速度，系统默认为最大（MAX）。其中加热最大速度是3.3oC/秒，冷却最大速度2.0oC/秒。两者的最小速度都是0.1oC/秒。用户可以在这之间调整。“RampTimeinsec〞的选项代表指定加热/冷却时间，用户可以在1秒（00:01）到99分钟59秒（99:59）之间调整。

ProtocolOption选项CycleName

PCR热循环文件表格抬头CycleDescription

选项功能及说明

选择该选项，表格中会多出表头为“Cycle