实验六抗体效价的Elisa测定

实验六抗体效价的Elisa测定第1页，共32页，2023年，2月20日，星期四2.基本原理免疫酶技术:酶标Ab/Ag,酶结合物的酶在免疫反应后，作用于厎物后显色，根据颜色的有无和深浅，定量测定Ab/Ag。免疫反应：一次或数次具Ag,Ab特异的免疫学反应酶促反应：只进行一次

显示出生物放大作用，灵敏度ng,pg第2页，共32页，2023年，2月20日，星期四60年代初期，Averameas&Ram等建立了免疫酶技术(immunoenzymatictechniques)

利用特殊的交联剂研制出辣根过氧化物酶---人血清白蛋白及酸性磷酸酯酶---抗体，统称为酶标记物或酶结合物，用于抗原或抗体的示踪、定位或定量测定第3页，共32页，2023年，2月20日，星期四酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbentassay简称为Elisa)-----是在免疫酶技术(immunoenzymatictechniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。本法兼有灵敏度高和特异性强两方面的优点。第4页，共32页，2023年，2月20日，星期四1974年Voller等用聚苯乙烯微量反应板作为免疫吸附剂吸附抗体(抗原)，再与相应的酶标记物结合操作更方便，易重复灵敏度可高达ng（10-9g）至pg(10-12g)，第5页，共32页，2023年，2月20日，星期四(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay)第6页，共32页，2023年，2月20日，星期四免疫标记技术第7页，共32页，2023年，2月20日，星期四应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定标记抗体或抗原荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂镜检观察或进行自动化测定荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测定仪等直接在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上,对抗原抗体反应进行定性和定位研究第8页，共32页，2023年，2月20日，星期四酶------性能稳定、经济易得、底物无色、产物显色，便于检测常用的酶:碱性磷酸酯酶、辣根过氧化物酶(horseradperoxidase简称HRP)、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等。酶标技术第9页，共32页，2023年，2月20日，星期四戊二醛法，过碘酸氧化法将酶与Ab交联在一起Ag-Ab-抗Ab-HRPTMB+H2O2产物（黄色，OD450)+H2O第10页，共32页，2023年，2月20日，星期四图一直接型Elisa

第11页，共32页，2023年，2月20日，星期四图二间接型Elisa第12页，共32页，2023年，2月20日，星期四图三双抗体夹心型ELISA第13页，共32页，2023年，2月20日，星期四图四固相抗体竞争型ELISA未知抗原量=A（1）-A（2）第14页，共32页，2023年，2月20日，星期四每次反应后都要反复洗涤？保证反应的定量反应防止重叠反应，引起非特异现象。第15页，共32页，2023年，2月20日，星期四第16页，共32页，2023年，2月20日，星期四Partiallypurified,inactivatedHIVantigensantigenspre-coatedontoanELISAplatePatientserumwhichcontainsantibodies.IfthepatientisHIV+,thenthisserumwillcontainantibodiestoHIV,andthoseantibodieswillbindtotheHIVantigensontheplate.

Anti-humanimmunoglobulincoupledtoanenzyme.Thisisthesecondantibody,anditbindstohumanantibodies.

substratewhichchangescolorwhencleavedbytheenzymeattachedtothesecondantibody.HIV(humanimmunodeficiencyvirus)detection第17页，共32页，2023年，2月20日，星期四positivenegative第18页，共32页，2023年，2月20日，星期四第19页，共32页，2023年，2月20日，星期四Proteinproteininteraction---ELISA1.DirectelisadifferentepitopeCoatwithpreyproteinIncubatewithbaitproteinPimaryAbantibaitprotein-----第20页，共32页，2023年，2月20日，星期四2.CompetitiveelisasameepitopeCoatwithbaitprIncubatewithprimaryantibodyantibaitprandvariousconcentrationpreyprotein第21页，共32页，2023年，2月20日，星期四第22页，共32页，2023年，2月20日，星期四4.操作方法4.1包被特异性抗原:固体抗原(如蛋白质)用包被液稀释至10Oμg/ml，每凹孔加100μL，加盖置4℃过夜(37℃2h)【已完成】次日倾去凹孔内液体，用滴管取洗涤液在每孔中加满稀释/洗涤液洗涤3次，首次洗涤静置2min后倾去，后两次静置1min。将反应板扣放在滤纸上，以除净液体。4.2封闭:每孔中加满封闭液（约300ul多），加盖或用封口膜封板，置37℃恒温箱60min，倾去孔内液体，按上法洗涤3次。第23页，共32页，2023年，2月20日，星期四4.3加待测血清(内含抗体)、阴性血清(无抗体)及稀释液(PBS/Tween):待测血清按倍比法用稀释液稀释(1:100、1:200等)，阴性血清也稀释成1:100，取不同稀释度的待测血清，阴性血清及稀释液(PBS/Tween)各1OOμL加至相应的凹孔中，加盖或封板，置37℃恒温箱1h，使抗体与固相抗原进行特异性结合，反复洗涤3次。第24页，共32页，2023年，2月20日，星期四12345678PBS/Tween1:100阴性血清1:1,0001:5,0001:10,0001:50,0001:100,0001:500,000阳性血清第25页，共32页，2023年，2月20日，星期四4.4加酶标抗体:加入HRP-抗体(抗抗体，本实验中已经根据说明书稀释一千倍)，每孔加l00μL，封板后置37℃温育lh，按上法至少洗涤5次，最后用蒸馏水洗涤2次，扣在滤纸上吸干水分。4.5显色:首先按每10mLOPD应用液加入0.15mLH2O2处理。每孔加入OPD应用液1OOuL、反应板置室温暗处5～30min。当显示明显黄色时应及时终止反应。4.6终止反应:每孔加入10OμL2mol/LH2SO4。由黄色变为橙色。稳定3～5min即可比色测定。第26页，共32页，2023年，2月20日，星期四4.7检测:用酶联免疫测定仪，以PBS/Tween孔为对照、测波长为49Onm时各孔光吸收（A）。计算阳性血清与阴性血清A值之比(Positive/negative，P/N)，当P/N≥2.1时为阳性，P/N<2.1而≥1.5为可疑，P/N<1.5为阴性。用目测法则以较阴性对照深色的最高稀释度作为抗体效价。用“＋”“－”表示，超过规定吸收值（0.2－0.4）的标本均属阳性。第27页，共32页，2023年，2月20日，星期四

注意事项

(1)聚苯乙烯微量反应板应选择高质量、非特异性吸附小的产品。包被物应具有较高的纯度，其浓度一般在1～100μg之间，在偏碱条件下易吸附于反应板的凹孔中，4℃放置过夜较理想，若暂时不用，可加入终浓度为0.02%NaN3，4℃贮存，也可倾去包被液，干燥后置硅胶干燥器中，室温存放3个月以上不影响测定效果。(2)反应各步均应充分洗涤，以除去残留物，减少非特异性吸附。为使结果重复应固定洗涤次数及放置时间，切忌相互污染。(3)为使显色反应便于比较，显色后置室温暗处的时间应一致，终止反应3～5min后应立即比色。必要时可设阳性对照，以固定显色及终止时间。(4)待测抗体或抗原与酶标抗体应具有相同的免疫特异性，否则无法结合。第28页，共32页，2023年，2月20日，星期四自动酶标仪（Elx800UV）使用程序1开机，进行Systemself-test…2按“DEFINE”键，进入“SELECTASSAYNUMBER”，用“NUMERIC”或“OPTION”键输入测试号（注：assay01为quickread，最大测试号为55）；按“ENTER”键修改测试的“NAME”；再按“ENTER”键进入下列菜单：按“METHOD”键选择测试的波长类型（Single或Dual）、波长大小(340、405、450、490或630nm)、微孔板类型(96孔、48孔或24孔)。按“MAP”键选择阅读方式(Auto或Manual)、阅读方向（Down或Across）、重复方向（Down或Across）、阅读起始位置（输入编号）、空白Map（Air、Full、Const、Column、P-Down、P-Across）。第29页，共32页，2023年，2月20日，星期四3按“READ”键，酶标板推进入仪器，开始读数并计数，打印机输出数据。4按“MAINMENU”键回到主菜单，关闭电源。

第30页，共32页，2023年，2月20日，星期四酶标板的清洗：采用ELx50TM型微孔板洗板机，注射泵驱动的液体输送，条状单排清洗或全板清