(28)-第3.2章单克隆抗体的制备二

第3.2章单克隆抗体的制备二大家好！本节课我要跟大家一起学习的内容是单克隆抗体的制备二。如何应用杂交瘤技术获得针对特定抗原的单克隆抗体？单克隆抗体制备的具体操作流程是什么？对此，（在介绍此标红部分内容时插入下面的文字和图片）下面我们将以人肌红蛋白单克隆抗体的制备为例进行具体的介绍。首先，用纯的人肌红蛋白去免疫小鼠，当小鼠外周血中的抗体水平达到一定效价时，处死小鼠，分离小鼠脾脏，将其研磨成单个细胞，在这些细胞里面就有我们所需的致敏B细胞。（在介绍此标红部分内容时插入下面的文字和图片）然后，将获得的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞在PEG的作用下进行融合，这个时候就可获得5种细胞：融合以及未融合的脾细胞、融合以及未融合的骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞。对于融合以及未融合的脾细胞，因其在体外不能长期存活，故很快走向死亡；而对于剩下的融合以及未融合的骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞而言，因其具有肿瘤细胞的永生性，因而可以在体外长期存活。那么，如何去除融合以及未融合的骨髓瘤细胞？这儿，（在介绍此标红部分内容时插入下面的文字和图片）我们会用到一种特殊的培养基：HAT培养基。融合以及未融合的骨髓瘤细胞在HAT培养基的筛选下会慢慢走向死亡，这样就只剩下我们想要的能产生人肌红蛋白抗体的杂交瘤细胞。该细胞既具有B细胞的能分泌单克隆抗体的特点，也具有骨髓瘤细胞的能在体外长期繁殖的特点。（在介绍此标红部分内容时插入下面的文字和图片）该细胞既具有B细胞的能分泌单克隆抗体的特点，也具有骨髓瘤细胞的能在体外长期繁殖的特点。接下来，我们来和大家一起具体的学习一下单克隆抗体制备的各个环节。（在介绍此标红部分内容时插入下面的文字和图片）首先看第一个环节：亲本细胞的选择与制备。这儿的亲本细胞包括致敏B细胞和骨髓瘤细胞。其中，对致敏B细胞的要求是要达到“三高”：能产生高特异性、高效价和高亲和力的抗体。（在介绍此标红部分内容时插入下面的文字和图片）对骨髓瘤细胞的要求有“4点”：第一、细胞株稳定，易于传代培养；第二、本身不分泌免疫球蛋白或细胞因子；第三、是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（即HGPRT）缺陷的细胞株，此种骨髓瘤细胞不能在HAT选择性培养基中生长；第四、与B细胞融合率高。另外，大家要知道，在杂交瘤技术中，我们所用的骨髓瘤细胞为B细胞系来源的恶性肿瘤。目前最常用的骨髓瘤细胞株是：BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系NS-1、SP2/0和Ag8。为防止骨髓瘤细胞在传代培养过程中出现恢复HGPRT活性的返祖现象，融合前，应将骨髓瘤细胞用含8-氮鸟嘌呤的培养基处理，以确保其对HAT选择性培养基敏感。下面我们再看单克隆抗体制备的第二个环节：细胞融合。（在介绍此标红部分内容时插入下面的文字）细胞融合是杂交瘤技术中的第一个关键环节。融合的方法包括化学方法、物理方法和生物学方法。其中在化学方法中最常用的试剂是聚乙二醇1000-2000，简称为PEG1000-2000，浓度为30%-50%，它可能的原理是导致细胞膜上脂类物质的物理结构重排，使细胞膜打开，从而有助于细胞融合。下面我们来看一下细胞融合的基本步骤：（在介绍此标红部分内容时插入下面的文字和图片）取适量的致敏B淋巴细胞与骨髓瘤细胞按一定比例（常用比例为3：1）混合，1000rpm离心10min，弃上清，然后加入1ml50%PEG，1min内加完，30秒后再加入40ml1640培养基，4min内加完，1000rpm离心10min，弃上清，最后加入HAT培养基，轻轻颠倒混匀，将细胞悬液加入96孔板中进行培养。接下来，我们来看单克隆抗体制备的第三个环节：杂交瘤细胞的选择性培养。这是制备单克隆抗体的第二个关键环节。前面我们提到，去除融合以及未融合的骨髓瘤细胞时，会用到一种特殊的培养基：HAT培养基。（在介绍此标红部分内容时插入下面的文字和图片）那么，HAT培养基究竟是什么培养基？这儿的H指次黄嘌呤，A指甲氨蝶呤，T指胸腺嘧啶。它是如何发挥筛选作用的？下面我们来看一下：在生物化学这门课中，我们已经学过DNA的合成。对于真核细胞来说，合成DNA的途径主要有两种：主要途径和旁路途径。正常情况下，DNA的合成是通过主要途径来完成的，即：细胞以糖、氨基酸及其小分子化合物作为底物，在二氢叶酸还原酶的作用下合成DNA。在这一过程中，叶酸作为辅酶，发挥了重要作用。而甲氨蝶呤是叶酸的拮抗剂，因而可阻断DNA合成的主要途径。在这个时候，DNA合成的主要途径被阻断了，只剩下旁路途径可供利用。在旁路途径中，细胞可以次黄嘌呤为原料，在次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的催化下合成鸟嘌呤和腺嘌呤；另以胸腺嘧啶为原料，在胸腺嘧啶激酶的催化下合成胞嘧啶，从而完成DNA的合成。次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶大家已经比较熟悉了，我们前面已经提到过，它的英文简称是HGPRT，胸腺嘧啶激酶的简称是TK。由于HAT培养基中含有叶酸拮抗剂—甲氨蝶呤，故细胞DNA合成的主要途径被阻断，只能依靠旁路途径来合成DNA。然而，用于融合的骨髓瘤细胞是经含8-氮鸟嘌呤的培养基筛选得到的HGPRT缺陷的细胞株，故不能利用次黄嘌呤，也就不能合成鸟嘌呤和腺嘌呤。尽管有TK存在可以合成所需的嘧啶，但是细胞终因缺乏嘌呤而不能合成完整的DNA导致融合以及未融合的骨髓瘤细胞在HAT培养基中不能增殖而死亡。而杂交瘤细胞由于从致敏B细胞中获得HGPRT，可以通过旁路途径合成DNA，同时又保留了骨髓瘤细胞在体外无限生长繁殖的特性。因此，经过筛选，到最后只有杂交瘤细胞能够在HAT培养基中得以生存而被筛选出来。下面我们再对前面所讲的内容帮大家梳理一下：HAT培养基的筛选原理是基于DNA合成的两条途径。在A存在的情况下，DNA合成的主要途径就被阻断了，只剩旁路途径。对于骨髓瘤细胞，因HGPRT缺乏，旁路途径也不能合成完整的DNA，故细胞经HAT培养基筛选后死亡，这样只剩下我们想要的杂交瘤细胞。这儿需要大家搞清楚3种细胞的酶特征：只有骨髓瘤细胞的HGPRT是缺乏的，而B细胞和杂交瘤细胞两种酶都有。接下来，我们来看一下HAT培养基的筛选流程：（在介绍此标红部分内容时插入下面的文字和流程图）在融合后的细胞悬液中加入HAT培养基，连续培养10天，期间半量换液2次，10天培养结束后加入HT培养基，连续培养7天，期间换液一次，最后加入完全的1640培养基。以上就是杂交瘤细胞选择性培养的技术要点。下面，我们来学习单克隆抗体制备的第4个环节：阳性杂交瘤细胞的筛选和克隆化。杂交瘤细胞在HAT培养基中生长和形成集落后，其中仅少数是分泌特异性抗体的细胞，对此，我们可以通过ELISA方法筛选培养孔上清液中是否含有目标抗体，从而确定哪些孔中含有我们想要的杂交瘤细胞。另外，在有的培养孔中，可能有多个细胞集落，分泌的抗体也可能不同，所以很有必要有针对性的进行单个杂交瘤细胞的培养。单个细胞培养又称克隆化，其目的是为获得单一细胞系的群体。阳性杂交瘤细胞的克隆化需反复多次（至少3-5次）才可以从细胞群体中淘汰遗传性不稳定的杂交瘤细胞，最终获得稳定分泌我们想要的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。细胞克隆化培养之初，可加入饲养细胞，如小鼠腹腔巨噬细胞，从而辅助杂交瘤细胞生长，一段时间后饲养细胞会自然死亡。（在介绍此标红部分内容时插入下面的文字）克隆化培养方法包括有限稀释法、显微操作法、流式细胞分选法和软琼脂平板法等。目前，实验室最常用的方法是有限稀释法，其原理是将处于对数生长期的杂交瘤细胞用培养液做一定稀释，最终使96孔板每个培养孔内平均含1个细胞，培养3-4天后，选择仅有1个细胞群落生长并且目标抗体呈阳性的孔，再反复多次克隆，即可获得由单个细胞增殖形成的同源性杂交瘤细胞克隆。该方法的优点是不需特殊设备，克隆出现率高，是实验室最常用的方法。显微操作法是在倒置显微镜下用特制的弯头毛细滴管吸出单个细胞，然后放入96孔板中培养。该法的优点是直观，铺板均匀，缺点是容易污染。流式细胞分选法是应用流式细胞仪筛选出能特异性表达目的单克隆抗体的杂交瘤细胞。本法是目前分离细胞最先进的方法，筛选效率高，细胞纯度高达90%，缺点是需要特殊的仪器才能完成。软琼脂平板法是将杂交瘤细胞培养在软琼脂平板上，待单个细胞形成集落后，再分离培养。本法中需要用到琼脂，琼脂融化温度比较难掌握，过高会导致细胞死亡，过低使细胞分布不均匀，克隆出现率也不够稳定。接下来，我们来了解一下单克隆抗体制备的第5个环节：（在介绍此标红部分内容时插入下面的文字）杂交瘤细胞的冻存和复苏。杂交瘤细胞的冻存方法跟其他哺乳动物细胞的冻存方法一样，均需要冻存在液氮中，冻存液中需要加入二甲基亚砜，均需遵循“缓冻速溶”的原则。下面，我们来学习一下单克隆抗体制备的最后一个环节：（在介绍此标红部分内容时插入下面的文字）单克隆抗体的生产。获得稳定的杂交瘤细胞株后，就可以大量制备单克隆抗体了。制备的方法主要有两种：动物体内诱生法和体外培养法。首先来看动物体内诱生法。杂交瘤细胞保留了骨髓瘤细胞的肿瘤特性，故将它接种到同系小鼠体内后，杂交瘤细胞就会大量增殖，同时分泌单克隆抗体。该实验一般这样来做：（在介绍此标红部分内容时插入下面的文字和图片）通常先给BALB/c小鼠腹腔注射降植烷或医用石蜡，造成无菌性腹膜炎，7-10天后将0.5ml含100万个杂交瘤细胞的悬液注射入小鼠腹腔，等到诱生出小鼠腹腔肿瘤并产生含单克隆抗体的腹水时，即可分次采集腹水。（在介绍此标红部分内容时插入下面的文字和图片）第二种制备单克隆抗体的方法是体外培养法。应用培养基大量培养杂交瘤细胞，在培养上清中即含有较多量的单克隆抗体。该方法与动物体内诱生法相比，生产成本高。为什么这么说呢？一只普通小鼠的价格是25元左右，但是每瓶约500ml培养基的价格约在100元左右。那么，与动物体内诱生法相比，该方法产生的单克隆抗体效价高还是低呢？答案是低，这意味着体外培养法的抗体产量也不高。所以，在制备单克隆抗体时，动物体内诱生法要优于体外培养法。这样，单克隆抗体制备的6个环节我们就讲完了。（在介绍此标红部分内容时插入下面的文字和图片）下面，我们以人肌红蛋白单克隆抗体为例，来帮大家再梳理一下单克隆抗体的制备流程，同时帮助同学们把这6个环节再复习一下：首先用人肌动蛋白免疫小鼠，待血清抗体效价达到一定水平时，处死小鼠，分离脾脏，制备致敏B细胞；同时准备好处于对数生长期的骨髓瘤细胞，将二者在PEG存在的情况下进行融合，然后加入HAT培养基，对于融合以及未融合的B细胞，其不能在体外长期存活，对于融合以及未融合的骨髓瘤细胞，再加上甲氨蝶呤阻断了它DNA合成的主要途径，又因其HGPRT缺陷，故DNA合成的旁路途径也被阻断。两条合成DNA的途径都被阻断了，所以骨髓瘤细胞也慢慢走向死亡。这时候培养基中就只剩下我们想要的杂交瘤细胞。为了筛选到能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，需进行克隆化培养，最常用的克隆化培养方法是有限稀释法。本法不需特殊设备，克隆出现率高。