8 试验3 漆酶产生菌的分开筛选

本文格式为Word版，下载可任意编辑——8试验3漆酶产生菌的分开筛选试验3漆酶产生菌的筛选

1.试验原理：

菌种筛选包括分开、初筛和复筛等几个步骤，挑拣具有某种能力的有用菌种，根据不同的筛选目的，采用不同的筛选路线。

白腐菌能够分泌胞外氧化酶降解木质素，被认为是最主要的木质素降解微生物。木质素降解酶系主要包括三部份:木质素过氧化物酶(Lip）、锰过氧化物酶(MnP)以及漆酶(Lac)。由于漆酶能把分子氧直接还原为水，与其他木质素降解酶相比，具有更大的实际应用价值。漆酶是一种含铜多酚氧化酶，分子量在64-390kD之间。由于漆酶具有氧化与木质素有关的酚类和非酚类化合物以及高度难降解环境污染物的能力,因此在食品工业、制浆和造纸工业、纺织工业、土壤的生物修复等领域具有广泛的应用前景，因此筛选高产漆酶的白腐菌显得至关重要。

由于木质素结构的繁杂性，可选用木质素类典型化合物，如单聚物香草酸、愈创木酚、苯酚、磷甲基苯酚；二聚物愈创木基甘油-B-松柏醇醚(GGE）、脱氢联松柏醇(DCA),1,2-二愈创木基丙烷-1,3-二醇等。可选用相对低廉的愈创木酚为唯一碳源的选择性培养基，从土壤中分开就可以筛选出产漆酶的木质素降解菌。漆酶可以使无色的愈创木酚氧化为褐色，因此愈创木酚平板可以作为漆酶的筛选平板。

对于白腐菌来说，变色圈的形成有两种：一种是变色圈在菌丝的外圈，此时菌丝圈直径度色圈直径小于1；另一种是变色圈，在菌丝的外圈形成菌丝圈直径与变色圈直径比值大于1的菌株。菌丝圈与变色圈直径的比值可作为判断该菌是否能选择性降解木素的依据，比值小于1则该菌能选择性降解木质素；比值大于1的菌则首先降解纤维素。由于选择性降解木质素的菌株在制浆造造纸等行业更显优势，因此本试验主要是筛选选择性降解木质素的菌株。

本次试验需6个课时，但试验周期较长。

2.试验材料

2.1仪器设备

电子天平、磁力搅拌器、高压灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、冰箱、纯水机、移液枪等。2.2试剂

葡萄糖、KH2PO4、MgSO4?7H2O、VB1、愈创木酚、酒石酸钾、蛋白胨、MgSO4、KH2PO4、Na2HPO4

琼脂等。另外需要未生芽的马铃薯。2.3器皿工具

打孔器、游标卡尺、培养皿(洗净烘干)、150mL三角瓶、250mL三角瓶、配套封口膜(配棉绳或橡皮筋)或硅胶塞若干、报纸一叠、15mL试管及配套硅胶塞(或试管帽、棉塞等)、玻棒、标签纸、记号笔(蓝、黑)、1000mL烧杯、50mL量筒、药匙、卫生纸、称量纸等。2.4培养基

PDA培养基：马铃薯提取液1L，葡萄糖20g，KH2PO43.0g，MgSO4?7H2O1.5g，VB1微量(约1mg)，琼脂15g，pH6.0。马铃薯提取液制法如下：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1L，煮沸30min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1L。灭菌后倒平板即可，并做斜面。

选择性培养基(g/L)：俞创木酚1.0，酒石酸钾0.1，蛋白胨2.6，MgSO4·7H2O0.5，KH2PO41.0，Na2HPO40.2，琼脂15g。灭菌后倒平板，即为漆酶产生菌筛选平板。

PDA-Bavendamm培养基：在PDA培养基中参与蹂酸至终浓度为0.01/100mL。

1

3.试验方法3.1试验准备

试验准备工作在试验课前一天晚上进行。主要工作是整理试验台，进行器皿耗材准备。配制培养基，同时准备在150mL三角瓶中参与45mL水，同时参与适量玻璃珠。以上材料灭菌备用。

3.2取样

在校园内取富含有机质的深层土样。

3.3分开纯化

将土样放入装有玻璃珠的三角瓶中，轻轻晃动三角瓶，用玻璃珠打碎土粒，静置30min，获得土壤浸提液。用接种环蘸取土壤浸提液，在筛选平板上连续划线，28℃培养2-3d。每天观测一次平板，至出现褐色菌斑为止，挑取菌丝，接种于斜面上28℃培养2d后保存于4℃冰箱中。3.4初筛

重新培养入选的菌株，每个菌株一个PDA平板，到覆盖整个平板为止。用无菌打孔器打取直径为0.3mm×0.3mm的菌块，接种到选择性培养基上，每个菌株做3个重复，在30℃条件下培养7d，观测菌落周边棕红色变色圈的形成，挑拣变色圈在菌丝外围形成的菌株，并测量记录菌丝直径(dl)、变色圈直径(d2)以及计算两者比值(dl/d2)。根据所产生变色圈的大小及变色程度,选出d1、d2比值较小且生活力较高的菌株并用保藏培养基留种。

3.5复筛

用打孔器打取经初筛后的菌株直径为0.3mm×0.3mm的菌块接种于PDA-Bavendamm平板上，28℃条件下培养7d，每个菌株做3个重复，观测变色圈的形成状况并记录显色时间，如能产生棕褐色轮环则为阳性反应(+)，反之则为阴性反应(-)，每天测量变色圈的直径，选择显色快、变色圈直径大的菌株保存。

3.6酶活性测定

将筛选出的菌株采用PDA平板培养,待长满平板后,用无菌打孔器切取培养好的菌落,接入产酶液体PDA培养基中,每瓶接种3个菌片,25±1、120r/min恒温振荡培养。每天取样一次，经8层纱布过滤，4℃、6000r/min离心10min，取上清液,用于酶活性测定。

测定方法：采用ABTS方法。总反应体系3mL中含0.5mol/L2,2'-连-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)溶液0.2mL,0.1mol/L醋酸钠缓冲液(pH4.5)2.7mL,酶液0.1mL启动反应。测定反应前3min内反应液在420nm处的吸光值增加。以煮沸灭活15min酶液做对照,酶定义为每分钟使1umol/LABTS转化所需的酶量为一个活力单位(U)。

3.7菌株保存

取经过初筛和复筛获得的菌株，接种于PDA斜面28℃培养后保存于4℃冰箱中备用。

4.本卷须知

4.1