同种异体骨移植修复过程中转化生长因子β1表达的实验研究

前言

转化生长因子β1（TGF-β1）是一种多肽类多功能生长因子，可以调节多种细胞或瘤细胞的生长分化，在骨组织中受损伤刺激可启动新生骨与软骨的生成。动物实验证明，外源性TGF-β1能够促进骨折愈合。目前认为，TGF-β1表达量的变化可直接反映成骨能力的强弱，其基因表达信号的强弱可反映生成量的多少。现在是1页\一共有44页\编辑于星期三本研究采用免疫组化和原位杂交方法，观察分析同种异体骨移植修复过程中，术后时间、移植骨处理以及供受体间主要组织相容性抗原是否相配等因素对移植骨局部内源性TGF-β1表达的影响，旨在为进一步研究异体骨移植愈合机理以及临床合理使用重组生长因子提供实验依据。现在是2页\一共有44页\编辑于星期三材料与方法

本研究采用2×2×4三因素析因试验设计方法。根据供受体间主要组织相容性抗原是否相配将实验动物随机分为两个大组，即主要组织相容性抗原相配组和不配组。各大组再随机分为两个处理组，分别是新鲜异体骨移植组和冷冻异体骨移植组。

一、实验设计现在是3页\一共有44页\编辑于星期三表1：实验动物分组情况及处理现在是4页\一共有44页\编辑于星期三二、实验动物选择选用健康、成年近交系LEW大鼠（主要组织相容性复合体单倍体型Rt.1l）和近交系DA大鼠（主要组织相容性复合体单倍体型Rt.1a），雄性，体重270-320克。北京大学医学部实验动物中心提供。现在是5页\一共有44页\编辑于星期三三、移植骨的制备LEW和DA大鼠各12只做为供体。无菌条件下取其双侧股骨，除去骨髓及附着软组织，修剪成3mm×4mm形状规则的半管状皮质骨块，0.9%氯化钠注射液反复冲洗。将其中24块皮质骨（LEW、DA大鼠股骨各12块）装入双层无菌血浆袋中，热压封口，置入-20℃低温冰箱中冻存2周，制成冷冻异体骨，植入前浸于30-37℃的0.9％氯化钠注射液中复温30分钟。将另外24块皮质骨做为新鲜异体骨，在2小时内植入受体。现在是6页\一共有44页\编辑于星期三

四、动物模型建立

LEW大鼠48只做为受体。0.6%戊巴比妥钠（5ml

/kg）腹腔注射麻醉，腹卧位固定，左后肢前外侧切口，长约3cm，切开皮肤、皮下组织，沿肌间隙分离，暴露股骨中段，口腔科高速裂钻截骨，造成股骨干中段3mm×4mm大小的骨缺损模型。将移植骨正位植入后，逐层缝合伤口。现在是7页\一共有44页\编辑于星期三

五、主要试剂TGF-β1免疫组化试剂盒及TGF-β1原位杂交试剂盒（武汉博士德生物工程公司提供）。现在是8页\一共有44页\编辑于星期三

六、观察方法取材后组织标本以10%中性福尔马林固定48-72小时；10%EDTA脱钙2周，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，5um连续切片，分别进行HE染色，TGF-β1免疫组化染色及原位杂交检测。光镜下观察各组移植骨修复情况。现在是9页\一共有44页\编辑于星期三

将已判定为阳性的组织切片，随机抽样做空白对照，以PBS缓冲液代替一抗或杂交液。其他步骤不变。以空白对照实验的染色程度确定是否阳性,≤空白实验染色强度为阴性,>空白对照染色强度为阳性。阳性表达以组织和/或细胞胞浆内出现棕黄色颗粒为判断标准。以乳腺癌标本作为阳性对照。现在是10页\一共有44页\编辑于星期三

七、图像分析和统计学方法1．骨组织形态计量分析

每张HE染色组织切片随机选取5视野，经计算机自动图像处理系统计算新生骨组织密度。新生骨组织密度=新生骨组织面积/总骨面积。2．TGF-β1原位杂交结果图像分析将原位杂交组织切片随机选取5个视野，经计算机自动图像处理系统提取图中表达阳性信号彩色阈值，计算平均光密度值。现在是11页\一共有44页\编辑于星期三

以上数据统计学处理采用SAS软件，进行2×2×4析因方差分析。数据以均数±标准差表示，P﹤0.05有显著性差异。现在是12页\一共有44页\编辑于星期三结果一、组织学观察※主要组织相容性抗原相配的新鲜异体骨移植：

⑴骨吸收不明显，死骨含量少。⑵术后1周，移植骨表面、髓腔及移植骨-宿主骨间隙有新生骨样组织生成；2周时，移植骨浅表处生成编织骨；4周，板层骨与编织骨掺杂出现；8周，板层骨排列整齐与移植骨紧密地整合在一起，髓腔再通。⑶上述部位增殖、分化的成骨细胞、间充质细胞内TGF-β1蛋白及mRNA表达阳性。现在是13页\一共有44页\编辑于星期三※主要组织相容性抗原相配的冷冻异体骨移植：⑴移植骨边缘有骨吸收现象，骨内有死骨成分。⑵术后第2周，移植骨周围、髓腔及移植骨-宿主骨间隙有新生骨样组织出现；4-8周时，板层骨、编织骨掺杂出现且位置表浅，髓腔内有残余骨小梁。⑶移植骨周围、髓腔及移植骨-宿主骨间隙增殖、分化的成骨细胞、间充质细胞内TGF-β1蛋白及mRNA表达阳性。现在是14页\一共有44页\编辑于星期三※主要组织相容性抗原不配的新鲜异体骨移植：⑴骨吸收活跃，且移植骨周围有大量多核巨细胞浸润。⑵术后2周，移植骨边缘及髓腔内有少量新生骨样组织出现；至8周时，新生骨组织很少，移植骨内仍有大片均质状死骨。髓腔无再通迹象。⑶上述部位增殖、分化的成骨细胞、间充质细胞内TGF-β1蛋白及mRNA表达阳性。现在是15页\一共有44页\编辑于星期三

※主要组织相容性抗原不配的冷冻异体骨移植：⑴移植骨边缘有骨吸收现象，骨内有死骨成分。⑵术后2周，新生骨样组织出现；4-8周时，板层骨、编织骨掺杂出现，位置表浅，与移植骨整合不紧密，髓腔内有残余骨小梁。⑶TGF-β1蛋白及mRNA表达主要定为于新生骨组织表面的成骨细胞、间充质细胞内。现在是16页\一共有44页\编辑于星期三图1．术后2周，主要组织相容性抗原相配的新鲜异体骨移植（HE×100）图2．术后2周，主要组织相容性抗原相配的冷冻异体骨移植（HE×100）图3．术后2周，主要组织相容性抗原不配的新鲜异体骨移植（HE×100）图4．术后2周，主要组织相容性抗原不配的冷冻异体骨移植（HE×100）

图1图2

图3图4现在是17页\一共有44页\编辑于星期三图5．术后1周，主要组织相容性抗原相配的新鲜异体骨移植（ISH×100）图6．术后1周，主要组织相容性抗原相配的冷冻异体骨移植（ISH×100）图7．术后2周，主要组织相容性抗原不配的新鲜异体骨移植（ISH×100）图8.术后2周，主要组织相容性抗原不配的冷冻异体骨移植（ISH×100）

图7图8

图5图6现在是18页\一共有44页\编辑于星期三

图9图10

图11图12

2

图9．术后4周，主要组织相容性抗原相配的新鲜异体骨移植（IHC×100）图10．术后4周，主要组织相容性抗原相配的冷冻异体骨移植（IHC×100）图11．术后8周，主要组织相容性抗原不配的新鲜异体骨移植（IHC×100）图12．术后8周，主要组织相容性抗原不配的冷冻异体骨移植（IHC×100）现在是19页\一共有44页\编辑于星期三

1．随时间延长新生骨组织密度逐渐增高，术后第8周新生骨组织密度最高（P﹤0.05）。2．主要组织相容性抗原相配与不配者之间新生骨组织密度有显著性差异（P﹤0.05）。二、骨组织形态计量分析现在是20页\一共有44页\编辑于星期三

3．冷冻异体骨移植与新鲜异体骨移植之间新生骨组织密度有显著性差异（P﹤0.05）。4.主要组织相容性抗原相配的新鲜异体骨移植新生骨组织出现最早，成骨效果最好，术后8周与其他各移植骨相比新生骨组织密度最高（P<0.05）。现在是21页\一共有44页\编辑于星期三表2骨组织形态分析结果

主要组织相容性抗原相配主要组织相容性抗原不配时间(周)新鲜异体骨冷冻异体骨新鲜异体骨冷冻异体骨10.2000±0.00330.1392±0.0029

0.1070±0.00320.1411±0.007320.5236±0.01880.3673±0.01960.1537±0.00650.3701±0.002040.6193±0.01740.4815±0.01350.2118±0.00240.4326±0.023880.7615±0.02000.7030±0.01060.3063±0.01590.6989±0.0096

现在是22页\一共有44页\编辑于星期三

1248图13骨组织形态计量分析结果时间（周）现在是23页\一共有44页\编辑于星期三

1．供受体间主要组织相容性抗原是否相配影响TGF-β1mRNA的表达强度（P<0.05）。2．移植骨冷冻处理影响TGF-β1mRNA的表达强度(P<0.05)。3．术后时间影响TGF-β1mRNA的表达强度（P<0.05）。术后8周时TGF-β1mRNA表达水平最低。4．时间、移植骨处理以及主要组织相容性抗原是否相配等因素之间存在交互作用（P<0.05）。

三、TGF-β1mRNA原位杂交检测图像分析现在是24页\一共有44页\编辑于星期三

主要组织相容性抗原相配主要组织相容性抗原不配时间(周)新鲜异体骨冷冻异体骨新鲜异体骨冷冻异体骨

11.4175±0.00290.9985±0.01440.2409±0.00750.4554±0.012820.8470±0.00850.7087±0.00160.2591±0.00151.0544±0.122440.6102±0.00350.4994±0.00170.2533±0.01030.4883±0.016180.4750±0.00470.4196±0.00180.2438±0.00610.4217±0.0187

表3术后不同时间各移植骨TGF-β1mRNA表达强度（平均光密度值）现在是25页\一共有44页\编辑于星期三

影响因素F值P值

主要组织相容性抗原(A)1277.55<0.05移植骨处理(B)71.19<0.05术后观察时间(T)449.16<0.05A×B887.30<0.05B×T67.89<0.05A×T393.78<0.05A×B×T30.99<0.05表42×2×4析因分析结果现在是26页\一共有44页\编辑于星期三

1248时间（周）图14术后不同时间各移植骨TGF-β1表达强度（平均光密度值）现在是27页\一共有44页\编辑于星期三讨论

一、骨移植修复过程中TGF-β1的表达特征目前已经知道，骨损伤修复过程中，TGF-β1早期主要源于血小板和局部血液凝固。血小板脱颗粒释放TGF-β1，刺激修复细胞如间充质细胞，成骨细胞增殖、分化，启动修复过程。局部的成骨细胞、破骨细胞可在TGF-β1的调节下使骨吸收、骨形成协调进行。现在是28页\一共有44页\编辑于星期三

本研究发现，异体骨移植修复过程中，移植骨局部TGF-β1的表达水平与成骨效果协同变化，随骨组织逐渐成熟而发生量的变化，呈现出由高到低的缓慢下降趋势，提示了在移植骨修复过程中，局部内源性TGF-β1对骨形成、骨改建起着重要调节作用，它可以根据损伤修复所需的生物学环境而发生量与分布的变化。现在是29页\一共有44页\编辑于星期三

现已证实，TGF-β1可诱导间充质细胞向成软骨细胞、成骨细胞转化，以软骨内成骨或膜内成骨的方式成骨。本研究观察到，异体骨移植成骨过程主要是以膜内成骨方式进行，软骨内成骨很少。原位杂交结果显示，在膜内成骨阶段TGF-β1mRNA表达量最高，随即呈现出下降趋势。现在是30页\一共有44页\编辑于星期三

这可能是骨移植时局部出血较少，有氧环境利于间充质细胞向成骨细胞转化，以膜内成骨的方式形成骨组织。这与骨折愈合过程中，局部TGF-β1mRNA的表达特征明显不同，即没有与软骨内成骨阶段有关的第二次峰值出现。现在是31页\一共有44页\编辑于星期三二、免疫排斥反应抑制TGF-β1的表达本研究表明，主要组织相容性抗原不配的同种异体骨移植的成骨效果明显不如组织抗原相配者。原位杂交结果也显示出同样的抑制特征。这说明供受体间主要组织相容性抗原不配抑制骨移植的修复过程以及局部内源性TGF-β1的表达。这一结论与以往研究结果是一致的。现在是32页\一共有44页\编辑于星期三

研究证明，骨细胞膜及细胞外骨基质中含有大量I、II类抗原分子。异体骨移植可以呈递抗原，诱发宿主产生以局部细胞免疫反应为主的排斥反应，导致移植骨周围炎性细胞浸润，毛细血管狭窄、闭塞，移植骨修复过程延迟或移植骨被超前吸收。现在是33页\一共有44页\编辑于星期三

同时，免疫排斥反应过程中还产生了许多细胞因子，如IL-1，TNF-α等，它们除参与免疫调节外，还可激活破骨细胞的活性促进破骨并抑制成骨。体外研究发现，IL-1，TNF-α可以促进FAS介导的人类成骨细胞凋亡，抑制TGF-β1的表达。

现在是34页\一共有44页\编辑于星期三

尽管同种异体骨植入体内后，处于一个低水平的免疫反应状态，不存在异体器官移植所出现的超急性排斥反应，但仍会给骨修复、塑型、重建带来不利影响，反映在分子水平上表现为TGF-β1表达水平的降低或延迟。现在是35页\一共有44页\编辑于星期三三、移植骨冷冻处理对TGF-β1表达的影响现已证实，异体骨经低温冷冻处理后可以降低其免疫原性，但同时其生物学活性也被减弱。这一现象的发生可能是移植骨内存活细胞死亡造成的。因为低温冷冻处理对移植骨而言，不仅仅是一个低温储藏的过程，植入前移植骨往往需要解冻，冻融的变化过程在改变抗原结构的同时，也会引起骨内存活细胞膜结构的破坏导致骨内细胞死亡。现在是36页\一共有44页\编辑于星期三本研究结果显示，低温冷冻处理对主要组织相容性抗原相配与不配的异体骨移植会造成两种截然不同的结局：对组织抗原相配者而言，表现为骨掺入延迟，TGF-β1mRNA表达水平降低；而对于组织抗原不配者，则表现为骨掺入加快，TGF-β1mRNA表达水平增高，并且在术后第2周达到高峰。这也说明了低温冷冻造成骨内存活细胞死亡以及细胞膜破坏，使与膜结构有关的抗原结构改变，移植物免疫原性下降。现在是37页\一共有44页\编辑于星期三

以往研究表明，移植骨的生物学作用主要体现在以下三个方面：一是提供移植骨本身内在的生物学活性物质，即骨内存活细胞及其产物；二是骨基质内活性生长因子诱导宿主来源的未分化间充质细胞成骨，即骨诱导作用；三是充当宿主新生骨组织长入的支架，即骨传导作用。现在是38页\一共有44页\编辑于星期三

本研究观察到，在冷冻异体骨移植物的周围及靠近边缘的部位有新生骨组织形成，同时局部也有TGF-β1mRNA及蛋白质存在。证明了冷冻异体骨移植，后两种成骨途径是可能的。但是这种源于骨吸收后细胞外基质内细胞因子的成骨将是十分