8356733-张耀全-半干旱雨养区苜蓿种植年限影响黄绵土N2O排放的微生物驱动机制

摘要紫花苜蓿因其优良的饲用价值和生态功能，在黄土高原环境建设和产业结构调整中发挥着重要作用。针对目前黄绵土区苜蓿草地N2O释放的微生物机理研究较少的现状，本研究以黄土高原半干旱雨养农业区不同年龄紫花苜蓿人工草地为研究对象，于2018-2019年采用静态箱-气相色谱法测定了不同种植年限（L2003、L2005、2012）苜蓿物候期N2O释放通量，同时借助基于MiSeq平台的高通量分子生物学测序技术测定了土壤氨氧化古菌（AOA）和氨氧化细菌（AOB）群落结构和丰度。通过研究不同种植年限紫花苜蓿土壤N2O排放动态和土壤中氨氧化微生物群落结构、丰度及其多样性及群落，解析黄土高原苜蓿草地系统土壤N2O排放的微生物驱动机制，为西部黄土高原苜蓿草地的合理利用和雨养农业系统生产力可持续发展提供理论参考。主要研究结论如下：（1）黄土高原半干旱雨养农业区苜蓿土壤为N2O排放源，并呈现出夏秋高春冬低的季节性变化规律；N2O排放通量呈现出明显的单峰变化趋势，并于二茬再生期（7月）达到排放峰值，排放通量分别为0.1679mg·m-2·h-1（2018）和0.1715mg·m-2·h-1（2019）；随苜蓿种植年限的延长，累积排放量及增温潜势增加。（2）半干旱黄绵土区苜蓿土壤AOA和AOB的丰度分别为6.14×106~12.68×106copies·g-1干土和0.27×106~7.7×106copies·g-1干土，表现为AOA丰度显著高于AOB；随苜蓿种植年限延长AOA群落丰度增加显著，但AOB丰度表现为先增加后降低；长期种植苜蓿显著降低土壤AOA群落多样性并提高其丰富度，但对AOB群落多样性和丰富度无明显影响。（3）半干旱黄绵土区苜蓿土壤AOA群落优势门（>1%）为泉古菌门（Crenarchaeota）和unclassified_norank_Archaea，相对丰度分别为51.50%-96.16%和3.80%-47.13%；优势属（>1%）为norank_c__environmental_samples_p__Crenarchaeota、unclassified_k__norank_d__Archaea和norank_c__environmental_samples_p__Thaumarchaeota，相对丰度为51.50%-96.16%、3.80%-47.13%和0.04%-1.10%（4）半干旱黄绵土区苜蓿土壤AOB群落优势门为变形菌门、unclassified_k__norank_d__Bacteria和ammonia_oxidising_bacteria_ensemble，相对丰度分别为45.28%-67.73%、20.92%-28.01%和10.96%-31.58%，长期种植苜蓿后显著增加变形菌门的相对丰度，并降低ammonia_oxidising_bacteria_ensemble的相对丰度；优势属为亚硝化螺菌属、unclassified_k__norank_d__Bacteria、norank_p__ammonia_oxidising_bacteria_ensemble、unclassified_o__Nitrosomonadales和norank_f__environmental_samples，其丰度分别为21.11%-52.01%、17.83%-28.01%、10.96%-31.58%、10.95%-23.07%和2.56%-15.96%，随苜蓿种植年限的延长而增加，亚硝化螺菌属相对丰度显著增加，norank_p__ammonia_oxidising_bacteria_ensembl相对丰度显著降低。（5）RDA分析结果表明，土壤有机碳（P=0.004）、硝态氮（P=0.025）、微生物量碳（P=0.013）、微生物量氮（P=0.048）和脲酶（P=0.005）是影响AOA群落结构的主要因素；土壤NH4+-N（P=0.014）和微生物量碳（P=0.037）是影响AOB群落结构的主要因素。（6）N2O排放通量同时受到环境因素和生物因素的共同影响，其中土壤温度、SOC、TN、NO3--N、MBC和pH是影响半干旱黄绵土区苜蓿土壤N2O排放通量的环境因素；AOA群落的norank_c__environmental_samples_p__Crenarchaeota、unclassified_k__norank_d__Archaea、norank_c__environmental_samples_p__Thaumarchaeota和norank_p__environmental_samples_k__norank及AOB群落的unclassified_k__norank_d__Bacteria影响黄绵土N2O排放通量的主要生物因子。关键字：黄绵土，紫花苜蓿，N2O排放通量；氨氧化古菌；氨氧化细菌；SummaryAlfalfaplaysanimportantroleinenvironmentconstructionandindustrialstructureadjustmentbecauseofitsexcellentfeedingvalueandecologicalfunctioninLoessPlateau.InviewofthestudyonmicrobiologicalmechanismofN2Oemissionofalfalfainloessialsoilisless,so,thisstudytookthealfalfawithdifferentgrowthyearsinsemi-aridrain-fedagriculturalareainLoessPlateauasresearchobject,staticchamber-gaschromatographictechniqueswereusedtocontinuouslymeasureandanalyzetheN2Ofluxesofalfalfawithdifferentgrowthyear(L2003,L2005,L2012)during2018to2019,quantitativePCRandIlluminaMiSeqhigh-throughputsequencingwereappliedtoinvestigateabundance,communitystructure,anddiversityofammonia-oxidizingarchaea(AOA)andammonia-oxidizingbacteria(AOB)inloessialsoilwithcontinuousalfalfagrowing.ThroughthestudyofN2Oemissiondynamicandtheabundance,diversity,communitystructureofAOAandAOBofalfalfasoilwithdifferentgrowthyears,torevealthesoilN2Oemissionofmicrobialdrivemechanism,inordertoprovidescientificbasisandeffectivetheoryreferenceforlucernelandrationalutilizationonwesternLoessPlateauandproductivitysustainabledevelopmentonrainfedagriculturalarea.Theresearchmainconclusionsareasfollows:TheAlfalfasoilinthesemi-aridrain-fedagriculturalareaoftheLoessPlateauistheN2Oemissionsource,andpresentstheseasonalvariationcharacteristicsofsummerandautumnarehigherthanspringandwinter.TheN2OemissionfluxshowedanobvioustrendofunimodalvariationandreacheditspeakinJuly,theemissionfluxswere0.1679mg·m-2·h-1(2018)and1715mg·m-2·h-1(2019),Withtheextensionofalfalfagrowthyears,thecumulativeemissionsandthewarmingpotentialgraduallyincreased,whichwasshownasL2003>L2005>L2012.ComparewithL2005andL2012,ThecumulativeemissionsandthewarmingpotentialweresignificantlygreaterinL2003thaninL2005andL2012,high4.47%and14.14%.TheabundanceofAOAandAOBinalfalfasoilwere6.14×106-12.68×106copies·g-1drysoiland0.27×106-7.7×106copies·g-1drysoil,andbothdecreasedgraduallywiththedeepeningofsoillayers.Withtheincreaseofalfalfagrowthyears,theAOAabundanceineachsoillayerwasL2003>L2005>L2012,andtheAOBabundancewasL2005>L2003>L2012,andweresignificantlycorrelatedwithsoiltotalnitrogen,nitratenitrogen,organiccarbon,microbialbiomasscarbon,microbialbiomassnitrogenandureaseactivity.(3)TherichnessanddiversityofAOAandAOBinalfalfasoilonLoessPlateauincreasedwiththedeepeningofsoillayer.Withtheextensionofalfalfagrowthyears,thediversityofAOAinthe0-30cmsoillayershowedL2003>L2005>L2012,andShannonindexbyL2012wassignificantlyhigherthanthatofL2003(P<0.05);TherichnessshowedL2012>L2003>L2005,thediversityofAOBshowedL2005>L2003>L2012,therichnessshowedL2003>L2005>L2012.In30-60cmsoillayer,thediversityofAOAshowedL2005>L2003>L2012,therichnessshowedL2012>L2003>L2005;ThediversityofAOBshowedL2012>L2005>L203,andtherichnessshowedL2003>L2012>L2005.CorrelationanalysisfoundthatthediversityofAOAandAOBweresignificantlycorrelatedwithsoilorganiccarbon,nitratenitrogen,microbialbiomasscarbon,microbialbiomassnitrogenandurease.Long-termcultivationofalfalfadidnotsignificantlyaffectthediversityofAOB.(4)Thedominantphylum(>1%)ofAOAwereCrenarchaeotaandunclassified_norank_Archaea,withrelativeabundanceof51.50%-96.16%and3.80%-47.13%,respectively.Thedominantgenera(>1%)werenorank_c__environmental_samples_p__Crenarchaeota,unclassified_k__norank_d__Archaeaandnorank_c__environmental_samples_p__Thaumarchaeota,withrelativeabundanceof51.50%-96.16%,3.80%-47.13%and0.04%-1.10%.Soilnitrate,organiccarbon,microbialbiomasscarbon,microbialbiomassnitrogenandureaseactivitieswerethemainfactorsaffectingAOAcommunitygeneragroups.Therelativeabundanceofalfalfawasnotsignificantlychangedaftercontinuousalfalfagrowing.Thedominantphylum(>1%)ofAOBwereProteobacteria,unclassified_k__norank_d__Bacteriaandammonia_oxidising_bacteria_ensemble,withtherelativeabundanceof45.28%-67.73%,20.92%-28.01%and10.96%-31.58%,respectively.Withtheincreaseofalfalfagrowthyears,therelativeabundanceofProteobacteriawassignificantlyincreased,andtherelativeabundanceofammonia_oxidising_bacteria_ensemblewassignificantlydecreased.ThedominantgenerawereNitrosospira,unclassified_k__norank_d__Bacteria,norank_p__ammonia_oxidising_bacteria_ensemble,unclassified_o__Nitrosomonadalesandnorank_f__environmental_samples,withtherelativeabundanceof21.11%-52.01%,17.88%-28.01%,10.96%-31.58%,10.95-23.07%and2.566-15.96%,whichweremainlyaffectedbytotalnitrogen,organiccarbon,microbialbiomasscarbon,microbialbiomassnitrogenandpH.Withtheextensionofalfalfagrowthyears,therelativeabundanceofNitrosospiraincreasedgradually,andtherelativeabundanceofnorank_psamammonia_oxidising_bacteria_ensembldecreasedgradually.(5)RDAanalysisresultsshowthatthesoilorganiccarbon(P=0.004)andurease(P=0.005)werethemostimportantfactorsinfluencingtheAOAcommunitystructure,soilnitritenitrogen(P=0.025),microbialbiomasscarbon(P=0.013)andmicrobialbiomassnitrogen(P=0.048)werethesecondaryfactorsinfluencingtheAOAcommunitystructure,soilammoniumnitrogen(P=0.014)andthemicrobialbiomasscarbon(P=0.037)werethemainfactorsinfluencingtheAOBcommunitystructure.(6)N2Oemissionisaffectedbybothenvironmentalandbiologicalfactors.Soiltemperature,totalnitrogen,soilorganiccarbon,microbialbiomasscarbonnitritenitrogenandpHareenvironmentalfactorsthataffectedN2Oemission,andthenorank_c__environmental_samples_p__Crenarchaeota,unclassified_k__norank_d__Archaea,norank_c__environmental_samples_p__Thaumarchaeota,norank_p__environmental_samples_k__norankofAOAcommunityandtheunclassified_k__norank_d__BacteriaofAOBcommunityarebiologicalfactorsthataffectedN2Oemission.KeyWords：N2O；Ammonia-oxidizingarchaea；Ammonia-oxidizingbacteria；Abundance；Communitystructure目录摘要 IISummary IV第一章绪论 11.1研究背景 11.2国内外研究现状 31.2.1苜蓿人工草地N2O排放研究 31.2.2N2O排放的环境影响因子 31.2.3土壤微生物介导的N2O排放研究 61.3研究内容 71.3.1黄土高原不同种植年限苜蓿草地温室气体排放特征 71.3.2土壤氨氧化微生物群落结构对苜蓿种植年限的响应 71.3.3苜蓿种植年限影响黄绵土N2O排放的机制 71.4技术路线 8第二章．材料与方法 82.1试验区概况 82.2实验设计 92.3测定指标及方法 92.3.1土壤温室气体的采集与测定 102.3.2土壤理化性状的测定 102.3.3土壤酶活性的测定 102.3.4土壤氨氧化微生物丰度及群落结构的测定 102.4主要计算方法 112.4.1温室气体排放通量的测定 112.4.2温室气体累积排放量 122.4.3增温潜势（GWP） 122.4.4多样性指数计算方法 122.5数据处理 14第三章．结果与分析 153.1黄土高原不同种植年限苜蓿草地N2O排放特征 153.1.1不同种植年限苜蓿土壤N2O排放的季节动态 153.1.2N2O累积排放量和增温潜势 163.2土壤理化性质对苜蓿种植年限的响应 173.2.1土壤水分对苜蓿种植年限的响应 173.2.2土壤温度对苜蓿种植年限的响应 183.2.2土壤养分对苜蓿种植年限的响应 193.2.3土壤微生物量碳、氮和酶活性对苜蓿种植年限的响应 203.3土壤氨氧化微生物群落结构和多样性对苜蓿种植年限的响应 213.3.1土壤AOA群落结构和多样性对苜蓿种植年限的响应 21土壤AOA丰度对苜蓿种植年限的响应 21土壤AOA多样性对苜蓿种植年限的响应 21土壤AOA群落结构对苜蓿种植年限的响应 223.3.2土壤AOB群落结构和多样性对苜蓿种植年限的响应 26土壤AOB丰度对苜蓿种植年限的响应 26土壤AOB多样性对苜蓿种植年限的响应 26土壤AOB群落结构对苜蓿种植年限的响应 273.3.3土壤理化因子对氨氧化微生物群落的影响 31土壤氨氧化微生物群落多样性与土壤理化因子相关性分析 31土壤氨氧化微生物群落结构与土壤环境因子相关性分析 32冗余（RDA）分析 343.4苜蓿种植年限影响黄绵土N2O排放的机制 363.4.1N2O排放通量与土壤物理性质的回归分析 363.4.2N2O排放通量与土壤因子相关分析 373.4.3N2O排放与土壤氨氧化微生物群落的相关分析 39第四章讨论与结论 414.1讨论 414.1.1种植年限对苜蓿土壤N2O排放的影响 414.1.2种植年限对苜蓿土壤氨氧化微生物群落特征的影响 424.1.3苜蓿种植年限影响黄绵土N2O排放的微生物驱动机制 444.2结论 44参考文献 46致谢 56作者简介 57导师简介 58第一章绪论1.1研究背景联合国环境规划署2019年发布的第10份排放差距报告显示[1]，2018年度的温室气体排放总量达到了历史以来的最高点，约为553亿吨，要实现《巴黎协定》目标所允许的温室气体排放水平，现在比以往任何时候都更迫切需要所有国家采取紧急行动，实现大幅度减排。近100年以来，干旱半干旱区温度增加最明显的地区，尤其是半干旱地区对全球变暖的贡献达到了44%。氧化亚氮（N2O）作为地球上三大主要的对流层温室气体之一，其辐射增温效应约分别占温室气体16%，它参与地球生态系统中的氮循环ADDINCNKISM.Ref.{F38998738B524e98B4EE60138AD3328D}[2-3]。N2O是大气中三种主要温室气体中浓度最低的，但其增温效应最高，约为CO2的50～200倍ADDINCNKISM.Ref.{C0BD9E542743461689C2406A5C5BDABD}[4]。N2O能在大气中停留很长时间，对环境的影响存在潜伏性和长期性ADDINCNKISM.Ref.{4A2064FA8962434a8F64C1A251B9182B}[5]，此外N2O还能与空气中的物质反应形成光化学烟雾，从而破坏臭氧层，因此，其也被认为是一种破坏大气中臭氧层的重要物质ADDINCNKISM.Ref.{FB648333BCD94251AF08421618A335B1}[6]。有研究发现，如果大气中的N2O浓度增加一倍，将破坏大气中约10%的臭氧层，导致穿过臭氧层的紫外线辐射显著增加，而达到地表的紫外线过多就会对人类身体健康产生不利影响ADDINCNKISM.Ref.{2F55FD2A74C74d1cA746C4FAE503A30D}[7-8]。普遍认为大气环境中的N2O大约有70%是自然排放的，剩余的30%主要是化石燃料的燃烧等人类活动产生的，而自然产生的N2O就包括有农田土壤、草地、森林排放出来的N2O，而农田生态系统中80%的N2O排放量主要是由于氮素利用不合理导致的ADDINCNKISM.Ref.{F1F2E8559C614588A20DCF37871CB0F3}[9-12]。控制土壤中N2O排放的过程包括硝化过程和反硝化过程，均是由微生物参与作用，而硝化过程中的氨氧化过程是土壤中氮循环的限速步骤，主要是在氨氧化古菌（AOA）和氨氧化细菌（AOB）的参与下完成ADDINCNKISM.Ref.{45BC83263B624be78C9382BCCFC0D40F}[13]。黄土高原属于典型的半旱地农业区，区内沟壑纵横、地形破碎，水资源严重缺乏。此外，黄土高原土壤类型为黄绵土，质地松软，抗冲蚀能力差，由于干旱少雨，导致地上植被稀疏，覆盖率低，导致其生态环境十分脆弱ADDINCNKISM.Ref.{CF5BB435B3C04c9e83A8D32E01172B8D}[14]。紫花苜蓿(Medicagosativa)是我国人工草地种植面积最大的草种,具有抗旱、耐寒、耐贫瘠、保持水土、产量高等优良特性和较强的生态适应性，而且还具有土壤改良、培肥地力、植物修复等众多生态功能ADDINCNKISM.Ref.{CE4BDF1D91EF456dA687FFED8E390827}[15-16]，其根系经根瘤菌侵染形成根瘤后能固定空气中的游离氮，增加土壤中的氮素含量，据估算，每公顷苜蓿草地每年可以从大气中固定35～305kgN素，远高于其他作物地和天然草地，在我国半干旱地区，每公顷苜蓿1年可在土壤中固定270kg氮，相当于825kg硝酸铵ADDINCNKISM.Ref.{ECD511F5156B4dd987442D34FA40B69A}[17]。紫花苜蓿由于抗逆性强，长期以来一直是该地区生态恢复的首选牧草，对西北旱地农业生态脆弱区的生态修复、土壤结构改善、土壤肥力增强、水土保持等有着重要作用，因此在黄土高原地区种植面积逐年扩大ADDINCNKISM.Ref.{7D440B2D1BD54ac3B66768AE84E0C84F}[18]。据统计，甘肃省豆科牧草的种植面积为758000hm2，其中紫花苜蓿种植面积约529000hm2，占国内总种植面积的三分之一，居全国首位ADDINCNKISM.Ref.{03382187D09947ce886F9D2FCC3C966F}[19]。目前，关于多年生苜蓿草地的研究大都集中在水分恢复效应[17]和养分变化[15-16]等方面，对苜蓿土壤温室气体排放研究也局限于土壤水分、温度等土壤理化的角度[2,9-10]，而基于微生物视角开展苜蓿土壤温室气体排放的研究相对匮乏。土壤微生物是土壤有效养分重要的库源和转化者，是土壤中的活性组分，每克土壤中栖息着大约100亿个微生物[20]，几乎所有的土壤生物化学过程都直接或间接地与土壤微生物有关。土壤微生物对生态系统功能如土壤结构维持、有机物质的分解和养分循环、温室气体排放等发挥着重要作用[21]。同时，土壤微生物能够迅速对周围环境的变化做出反应，是表征土壤质量变化最敏感、最有潜力的指标[22]。氨氧化细菌（Ammonia-oxidizingbacteria，AOB）和氨氧化古菌（Ammonia-oxidizingArchaea，AOA）在氨单加氧酶和羟胺氧化还原酶的催化下，将NH3氧化成NO2，是硝化作用的关键步骤，也是限速步骤[23]，该过程的中间产物NH2OH会发生化学分解而释放出N2O。研究表明，在35%～60%孔隙含水率（Waterfilledporespace，WFPS）时硝化作用是土壤N2O排放的主要来源[24]。本研究依托布设在甘肃省定西市安定区李家堡镇的甘肃农业大学旱地农业综合试验站的长期定位试验，测定生育期和休闲期不同种植年限苜蓿土壤N2O气体排放动态，同时采用定量PCR和IlluminaMiSeq高通量测序分析不同种植年限的苜蓿土壤AOA和AOB的丰度、多样性以及群落结构，探讨N2O排放通量与其相关非生物因素和生物因素的偶联关系，明确影响N2O排放的主控因子，解析黄土高原不同种植年限苜蓿地N2O排放的微生物学驱动机制。1.2国内外研究现状1.2.1苜蓿人工草地N2O排放研究农业土壤作为N2O气体的重要排放源，释放量占全球总量的70%～90%ADDINCNKISM.Ref.{B3554894DC164936832BF8DA9CA8D77F}[3]。其产生途径包括反硝化作用、硝化作用、硝化微生物的反硝化作用及硝酸盐异化还原成铵等作用，其中硝化作用和反硝化作用是农业土壤产生N2O的最主要途径ADDINCNKISM.Ref.{3A9C586F18A148e2BD8A35FC626BA57E}[25-26]。有研究发现[27]，氧化亚氮排放通量有着明显的季节变化规律，不同作物在不同生育期排放的N2O量也不相同。段翠清等ADDINCNKISM.Ref.{766AB84DC9034b718EE52713C22E682E}[27]对陇中黄土高原8年苜蓿地生育期N2O的排放动态研究表明，土壤对N2O呈吸收排放状态，苜蓿地N2O的变化范围为0.02-0.11mg·m-2·h-1，苜蓿地的综合增温潜势显著低于农田的综合增温潜势。王涛ADDINCNKISM.Ref.{03B44B48D878424b89EBFC5E9AA4894E}[28]等对黄土高原旱塬区陇东苜蓿草地N2O释放动态研究表明，从返青期至越冬期，3年龄陇东苜蓿草地N2O释放通量在-0.099～0.085mg·m-2·h-1间，并呈上升－下降－上升－下降的变化趋势，远低于湿地生态系统和国际释放平均水平0.627mg·m-2·h-1。因此，旱塬区陇东苜蓿草地是较弱的N2O排放源。徐坤ADDINCNKISM.Ref.{0523C33A32BD411eAA41ABB504CD8EA6}[29]对宁夏地区不同种植年限苜蓿地温室气体排放通量研究发现，不同种植年限苜蓿地土壤植被系统与土壤系统的N2O通量排放趋势基本一致，呈现出“夏秋高冬季低”的季节变化规律，总体表现为：4a>5a>3a>8a>1a，并且在5月和8月中旬各出现了N2O排放峰值，表现出的“源”效应。N2O排放通量受到种植年限的影响，排放最高值出现在4年生的苜蓿地中，而排放最低值出现在1年生的苜蓿地中。1.2.2N2O排放的环境影响因子土壤质地通过影响土壤的通气状况及土壤含水量，从而影响到土壤中硝化潜势和反硝化潜势，以及氧化亚氮在土壤中的扩散速率，同时土壤有机物质的分解速率也与土壤质地息息相关，其通过影响产生氧化亚氮的底物供应进而影响到土壤中的氧化亚氮排放[30]。目前土壤质地对旱地农田土壤氧化亚氮排放通量的影响已有一些研究[31-32]。对旱地农田土壤氧化亚氮排放通量的研究发现由于重质地土壤保水能力强，因此在该质地旱地土壤中，氧化亚氮的排放通量较高，而在轻质地的旱地土壤中，排放通量相对较低，这可能是因为重质地的旱地土壤具有更强的保水性能。徐华等[33]通过研究土壤质地对农田旱地土壤氧化亚氮的排放发现，不同土壤质地的小麦和棉花地中，氧化亚氮排放通量表现为壤土最高，其次为沙土，粘土最低。土壤氧化亚氮排放量在不同质地水田中略有不同，李良谟和伍期途[34]研究结果表明，在水稻苗期不同土壤质地的氧化亚氮排放通量依次为红壤型水稻土>潜育型水稻土>淹育型水稻土；徐华等[35]通过研究不同质地土壤的氧化亚氮排放发现，沙质稻田土壤中的氧化亚氮排放通量显著高于壤质和粘质稻田土壤。此外，在不同质地的土壤中施用氮肥对氧化亚氮排放的影响也有所不同，Mosier等[36]研究发现，在粘质壤土中，氧化亚氮排放通量对氮素的变化有着更敏感的响应，在沙质壤土中，氧化亚氮排放通量对氮素含量的变化没有明显的响应。也有研究发现，在土壤孔隙含水量较高条件下，粘土氧化亚氮排放的增加是由于粘质土壤的温度系数Q10比沙质土壤大，促进了反硝化作用[37]。土壤温度通过影响土壤内部微生物活性、硝化和反硝化速率以及N2O传送速率等多方面，进而左右土壤N2O的排放ADDINCNKISM.Ref.{4D0FB0D55A80425fB57C18306A9ADD19}[38]。有研究表明ADDINCNKISM.Ref.{C31A8D145A674af6B23361FAA5BB197B}[39]，苜蓿地N2O排放通量与5cm地温呈线性函数关系，土壤N2O排放通量发生的频率呈现正态分布，15-25度范围内集中了67%的排放量ADDINCNKISM.Ref.{EC700CC493924823820374795E390D61}[40]。另外，温度对土壤N2O排放通量的影响随土壤深度增加而逐渐减弱ADDINCNKISM.Ref.{9EA7584B69704e3dBC4CC229605C741C}[41]，温度过低时，土壤主要表现为对N2O的吸收。高琳等ADDINCNKISM.Ref.{BFF5A4E348AF4e11BCDBF29B54A9C22E}[42]对马铃薯地温室气体排放量进行研究发现马铃薯田N2O排放通量分别与采气时段土壤5cm、15cm和25cm的温度均呈明显的负相关关系(P<0.05)，这可能与N2O的季节排放规律和温度的季节性变化有关。土壤水分主要通过影响土壤通气状况、土壤的氧化还原状况以及土壤中微生物的活性来影响土壤N2O的排放。有研究表明ADDINCNKISM.Ref.{F5274F40D299458b9FF539E8484B91DC}[43]，孔隙含水率在35%～60%时，硝化作用是土壤N2O排放的主要来源，而在土壤孔隙含水率为70%时，所有的N2O排放量均来自于反硝化作用，但是当土壤完全淹水时，由于反硝化作用进行完全降低了土壤N2O的排放量。此外，干湿交替过程可引起土壤硝化作用和反硝化作用交替产生N2O，并且抑制N2O继续还原为N2，从而促进N2O的产生与排放。孙海妮ADDINCNKISM.Ref.{49BBD11A48D74516A3605D1B039AF35A}[44]在黄土高原半干旱区进行研究发现N2O排放峰均出现在施肥、降水雨或灌水后，这与宋丽娜ADDINCNKISM.Ref.{F936EA8C7FC84b74A14CBDBA786CD3AD}[45]的研究结果一致，这可能是灌水以后土壤由干变湿含水量增加，土壤进行干湿交替，促进硝化与反硝化作用释放更多的N2O。大部分异养微生物的生长与繁殖均离不开土壤中的碳氮养分，因此土壤中的碳氮含量被认为是是调控N2O排放的重要因子[46]，研究发现土壤碳氮含量与N2O排放通量之间都具有显著正相关关系。因为土壤全氮与土壤有机质有着直接的耦合关系，有机质的含量对矿化作用有直接影响[47]，硝化和反硝化微生物在转化土壤中的NH4+和NO3－时，需要吸收利用土壤中的碳氮养分作为能源，但土壤中的碳氮含量较高时，异养硝化和反硝化微生物活性增强，促进了硝化和反硝化过程，从而产生大量的N2O[48]。此外，N2O通量还与氮的矿化速率有关[49]，随着土壤全氮和有机质含量的增加，N2O的排放通量增大。N2O释放同时受硝化和反硝化作用过程的控制[50-51]，与土壤中硝化细菌和反硝化细菌的活性、数量和种类有关。植物种类也影响着N2O的释放，豆科作物N2O的释放量显著高于非豆科作物[52]。豆科植物的生物固氮特性在增加植物可利用氮素的同时，也为硝化和反硝化过程提供了额外的底物，如大豆地N2O释放量显著高于玉米地[53]，加拿大农业领域释放的N2O中有22％来源于豆科作物[54]。袁红朝等[55]发现土壤中有机碳含量的增加会促进土壤中的反硝化微生物活性，导致土壤中排放的N2O增加。而且土壤C/N比也会影响氮素的转化过程，从而影响到N2O的排放。通常土壤C/N比为25～30时，微生物比较活跃，当C/N比高于30时，有机碳分解速率下降，微生物活性逐渐降低，土壤N2O的排放受到抑制;当C/N比低于25时，有机碳分解速率逐渐增加，微生物活性逐渐增强，使土壤N2O的排放速率逐渐增加[56]。土壤pH值可通过影响与氮转化相关的微生物的活性及改变相应的氮素转化过程而影响N2O的排放。研究发现，中性或弱碱性的土壤环境更适宜硝化和反硝化微生物的生存[57]，当土壤碱性较强时，反硝化酶Nos的活性增强，然而当土壤酸性较强时，反硝化酶Nos的活性逐渐降低，其他反硝化酶的活性增强，导致反硝化过程产生的N2O通量增加[58]；此外，当土壤pH降低时，有机碳的分解速率也随之降低[59]，减少了硝化和反硝化过程中消耗的氮素，从而使土壤排放的N2O减少；同时pH可以影响土壤中反硝化微生物的活性，进而影响氮素平衡。但土壤偏碱性时，NO2－可以在土壤中暂时积累，当土壤酸化严重时，NO2－直接参与反硝化过程最后生成N2O[60]。可见土壤pH也是影响农田N2O排放的主要因素之一。1.2.3土壤微生物介导的N2O排放研究土壤氮循环主要包括4个过程，固氮作用、硝化作用、反硝化作用及氨化作用ADDINCNKISM.Ref.{08AD5B2DA3B744109D2C66D60561452E}[13]，其中氨氧化作用作为硝化作用的第一步,是硝化作用的限速环节，也是将铵态氮(NH4+-N)转化为亚硝态氮(NO2--N)的主要途径，主要由氨氧化古菌（Ammonia-oxidizingarchaea,AOA）和氨氧化细菌（Ammonia-oxidizingbacteria,AOB）共同完成ADDINCNKISM.Ref.{21FB466BAD1B491fA45B368250F824E0}[61-63]，其过程主要分为两个部分，氨（NH3）在氧气充足的情况下，被氨单加氧酶(ammoniamonooxygenase,AMO)催化，最后生成NH2OH和H2O；NH2OH和H2O在羟胺氧化还原酶的作用下生成下NO2-，由于AMO只催化分子态的NH3，而土壤中的氨的形态主要为NH4+，导致土壤中NH3的浓度不断降低，使得氨的氧化成为硝化过程的限速步骤，因此也受到越来越多的人的关注，并成为研究热点之一。农田土壤中排放的N2O主要来自于氨氧化微生物主导的硝化过程以及反硝化微生物作用的反硝化过程，其中氨氧化作用中的AOA只能通过中间产物NO和羟胺的非生物反应产生N2O[64]，而AOB可以在硝化-反硝化耦合作用中产生N2O，也可以在羟胺氧化中产生的一氧化氮还原酶(Nor)的催化作用下产生N2O，因此，农田土壤中氨氧化微生物的群落结构及丰度对会对土壤N2O的排放产生影响[65]。氮素含量和土壤理化性质通过影响氨氧化微生物和反硝化微生物的丰度和群落结构来影响土壤硝化作用和反硝化作用的强度[66-67]，从而影响土壤N2O的排放。在氮素含量较高的中性和碱性土壤中，AOB是硝化过程N2O产生的主要驱动者[68]，而在氮素含量较低的酸性土壤中，AOA是硝化过程N2O产生的主要驱动者[69]。当土壤中的铵浓度较高时，此时氨氧化微生物主导的硝化作用释放出大量的N2O[70]。反硝化作用是农田生态系统中土壤氮素损失的重要途径，该过程中产生的N2O也是主要的温室气体。有研究者估计，全球70%的N2O排放来自土壤[71]。其中农业生态系统的排放量约占25%[72]。作为土壤氮素循环重要组成部分的反硝化作用是在硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、NO还原酶和N2O还原酶4种酶连续催化下将NO3还原为N2过程。由亚硝酸盐还原为NO的过程是反硝化作用区别于其他硝酸盐代谢的标志性反应，也是反硝化过程中最重要的限速步骤，亚硝酸盐还原酶(Nir)是执行该步骤的限速酶。因此，nir基因也成为反硝化细菌功能基因中研究最多的基因[73]。亚硝酸还原酶有两种不同结构形态，一种酶由含有铜基（Cu-nir）的nirK基因编码，另一种由含有亚铁血红素cd1（cd1-nir）的nirS基因编码[74]。很多研究将nirK和nirS基因作为环境样品中反硝化微生物的分子标识物。作物类型[75-77]、肥料类型及施用量[78-79]、土地利用方式[80-82]、温度[83-84]、土壤含水量[83]、pH值[83-84]等因素的变化均可导致具有Nir酶的反硝化细菌群落变化，且在环境中nirK基因比nirS基因的分布更广泛、对环境因子的响应也更敏感[75]。1.3研究内容1.3.1黄土高原不同种植年限苜蓿草地温室气体排放特征采用静态箱法结合气相色谱仪，监测不同种植年限苜蓿生育期和休闲期N2O排放动态，明确不同种植年限苜蓿地N2O排放规律。1.3.2土壤氨氧化微生物群落结构对苜蓿种植年限的响应采用基于MiSeq平台的高通量分子生物学测序技术，对氨氧化古菌（AOA）和氨氧化细菌（AOB）群落结构、丰度、和多样性进行量化分析，揭示不同种植年限苜蓿土壤AOA、AOB群落的分布格局和主要影响因子。1.3.3苜蓿种植年限影响黄绵土N2O排放的机制借助回归分析和冗余分析（RDA），分析探讨N2O排放通量与其相关非生物因素和生物因素的偶联关系，明确影响N2O排放的主控因子，解析黄土高原不同种植年限苜蓿地N2O排放的微生物学机制。1.4技术路线第二章．材料与方法2.1试验区概况本试验于2018年3-2019年10月在甘肃省定西市安定区李家堡镇麻子川村甘肃农业大学旱作农业综合试验站（104°44′E，35°28′N）进行，该区属于典型的黄土高原半干旱雨养农业区，平均海拔2000m，年均太阳辐射592.9kJ·cm2，平均日照时数2476.6h，年均气温6.4℃，>0℃的积温2933.5℃，>10℃的积温2239.1℃，无霜期1410d，年均降雨量400mm，年蒸发量1531mm，干燥度2.53。2018-2019年降雨量分布如图1所示。图1.试验地月降雨量分布Fig1.Distributionofmonthlyrainfallin2018-01~2019-12inDingxi(mm)2.2实验设计试验共设3个处理，分别为2003年(L2003)、2005年（L2005）、2012年（L2012）建植的紫花苜蓿，每个处理均为3次重复，各小区面积均为3×7=21m2，苜蓿品种为当地传统品种陇东苜蓿，苜蓿建植当年施纯N105kg/ha，纯P2O5105kg/ha，之后试验期间未施肥灌水，各处理田间管理保持一致，每年刈割两次，分别为6月上旬和10月上旬。2.3测定指标及方法2018年5月20日（苜蓿头茬盛花期），分别采集不同种植年限苜蓿地中0-30cm和30-60cm土层土壤样品，采用五点取样法，各取样点直线距离大于等于50cm，混合均匀后除去土样中的石块及作物残茬，将土样分为三份，一份在田间放入干冰箱带回实验室置于-80℃保存，用于土壤中氨氧化微生物群落结构及丰度的测定；一份土样放入4℃冰箱保存，使其保持生理活性，用于土壤中微生物量碳、微生物量氮、硝态氮、铵态氮以及硝化潜势的测定；剩余一部分土样待风干后带回实验室用于土壤中全氮、有机碳、pH、脲酶、过氧化氢酶及硝酸还原酶的测定。2.3.1土壤N2O气体的采集与测定从2018年3月至2019年10月，每半月采集一次，N2O用静态箱法采集，采样箱由1mm厚304K薄不锈钢板制成，箱体直径38cm，高35cm，底座内径36.5cm，埋入各小区中央，全年内无移动。箱体外覆反光铝箔保温膜，箱顶有一圆形塞口，用于插入温度计，读取箱内温度，箱内侧壁装有一个宽为10cm的塑料制风扇，用来混匀气体，箱体侧壁有一个采气孔，并连接一根橡胶管用于注射器采样。采样时将采样箱完全扣入底座凹槽并加水密封，箱顶圆形塞口插入温度计并接通风扇电源后用注射器分别采集100mL0min、10min、20min时的气体样品注入德霖铝箔采样袋中，密封保存，每次采样结束后立即将样品带回实验室分析。N2O使用安捷伦7890A型气相色谱仪(7890AGCSystem，USA)进行气体样品分析，色谱条件为色谱柱：PoraparkQ15m×0.53mm×25μm，进样口150℃，分流进样，检测器为ECD，检测温度300℃，柱温45℃，柱流速3.3ml·min-1，载气为高纯N2。2.3.2土壤理化性状的测定土壤全氮采用凯氏定氮法ADDINCNKISM.Ref.{FE1FC5B1D3FF4d7eBB06021CCD4D9DA3}[85]；土壤有机碳采用重铬酸钾-浓硫酸外加热法ADDINCNKISM.Ref.{C3251DE8904647aaB5C28E863AF1FC05}[85]。硝、铵态氮采用2mol·L-1KCl浸提，半自动化学间断分析仪（SmartChemAST-6500S）测定ADDINCNKISM.Ref.{86633B0B5AB04ca99DED55FF37B1D0FA}[85]；土壤微生物量碳、氮采用氯仿熏蒸—硫酸钾浸提，碳氮联合分析仪测定ADDINCNKISM.Ref.{D7ECCA00B2024a2381EDD338CFA4FF30}[85]；土壤温度采用曲管地温计；土壤水分采用烘干法；土壤pH采用PB-10酸度计测定。2.3.3土壤酶活性的测定土壤脲酶采用苯酚钠-次氯酸钠比色法ADDINCNKISM.Ref.{4C6BE2F89B9E4cf3B68993B0EF67A9E5}[86]；土壤过氧化氢酶采用高锰酸钾滴定法ADDINCNKISM.Ref.{A66DBEFE640D4d01A5EBF64E298D995D}[86]。土壤硝酸还原酶采用酚二磺酸比色法ADDINCNKISM.Ref.{0CC7633A3A6C4030A2C3213BA969618A}[86]。2.3.4土壤氨氧化微生物丰度及群落结构的测定DNA提取：土壤微生物群落结构土壤总DNA采用PowerSoil®DNA提取试剂盒提取，所提取的DNA的纯度用1.0%琼脂糖凝胶电泳跑胶，用溴化乙锭染色之后在凝胶成像系统检测。荧光定量PCR：DNA提取后，利用目标基因引物Arch-amoAF/Arch-amoARADDINCNKISM.Ref.{431798A6C936492d94E87B615B924CFC}[87]和AmoA-1F/AmoA-2RADDINCNKISM.Ref.{104E14C0CF67434dB8CE3F0B332D255F}[88]进行PCR扩增，PCR采用TransGenAP221-02：TransStartFastpfuDNAPolymerase，PCR仪为ABI7500型荧光定量PCR仪。引物序列及反应条件见表1。完成反应条件的所有步骤后，把加好样本的96孔板放在ABI7500型荧光定量PCR仪中进行反应。每个样本3个重复，以无菌水为空白阴性对照。将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluor™-ST蓝色荧光定量系统（Promega公司）进行检测定量。IlluminaMiseqPE300测序：对PCR产物进行定量并均一化混匀，利用聚合DNA产物构建Miseq文库，然后借助高通量测序平台（IlluminaMiseqPE300）测序，由上海美吉生物医药科技有限公司完成。表1目标基因的引物名称及引物序列Table1Primernamesandprimersequencesoftargetgenes2.4主要计算方法2.4.1温室气体排放通量的测定f=[(ρ2/t2-ρ1/t1)×H×M0×273]/（∆t×22.4）上式中，f代指N2O气体排放通量（mg·m-2·h-1）。H为采样箱高度（m）；M0代指具体气体分子量；∆t为结束采样时间与开始时间之差；t1、t2分别代指静态箱关闭和开始过程对应的箱内温度（K）；ρ1、ρ2分别代指静态箱关闭时与开启时的内部的体积浓度（mol·mol-1）。2.4.2温室气体累积排放量M=Σ[(fi+1+fi)×0.5×(di+1-di)×24×0.01]式中，M为整个测定期内温室气体（N2O）的累积排放量（kg·m-2）；f为温室气体（N2O）的排放通量（mg·m-2·h-1）；i=1、2…n为采样系数；di+1-di为两次采样间隔天数。2.4.3增温潜势（GWP）累计增温潜势(GWP)GWP=M(N2O)×265[1]本研究以1kgCO2的增温潜势为1，1kgN2O的增温潜势分别为1kgCO2的265倍[3]。M(N2O)代表整个测定期内N2O累计排放量（kg·m-2）。2.4.4多样性指数计算方法Chao1：是用chao1算法估计样本中所含OTU数目的指数，chao1在生态学中常用来估计物种总数。本次分析使用计算公式如下：Schao1=Sobs+n其中Schao1=估计的OTU数；Sobs=实际观测到的OTU数；n1=只含有一条序列的OTU数目（如"singletons"）；n2=只含有两条序列的OTU数目（如"doubletons"）。Ace：用来估计群落中OTU数目的指数，是生态学中估计物种总数的常用指数之一，与Chao1的算法不同。本次分析使用计算公式如下：SACE=S其中，Nrate=i=1abundini；yyniSrateSabundabund=“优势”OTU的阈值，默认为10。Simpson：用来估算样本中微生物多样性的指数之一，在生态学中常用来定量描述一个区域的生物多样性。Simpson指数值越大，说明群落多样性越低。D其中，SobsniN=所有的序列数。Shannon：用来估算样本中微生物多样性的指数之一。它与Simpson多样性指数类似，常用于反映群落alpha多样性。Shannon值越大，说明群落多样性越高。H其中，SobsniN=所有的序列数。Coverage：是指各样本文库的覆盖率，其数值越高，则样本中序列被测出的概率越高，而没有被测出的概率越低。该指数反映本次测序结果是否代表了样本中微生物的真实情况。C=1-其中，n1N=抽样中出现的总序列数目。2.5数据处理使用Mothur指数分析，用于指数评估的OTU相似水平97%，得出土壤氨氧化微生物Alpha多样性指数（Shannon和Sobs）、菌群丰富度指数（Chao1和ACE）。土壤理化性质、AOA和AOBamoA基因拷贝数、微生物群落α多样性指数均采用SPSS22.0和Excel数据处理软件,差异显著性分析利用单因素方差分析(ANOVA)、多重比较法(Duncan)和回归分析。土壤理化性质与氨氧化微生物群落结构相关性分析采用Speraman相关分析法，N2O与氨氧化微生物群落结构的相关性热图采用HEMI软件分析，并用AI软件修饰，冗余分析（RDA）采用上海美吉公司I-Sanger云平台进行处理，用AI软件进行修饰。第三章．结果与分析3.1黄土高原不同种植年限苜蓿地N2O排放特征3.1.1不同种植年限苜蓿土壤N2O排放的季节动态图3-1不同种植年限苜蓿土壤N2O排放通量Fig3-1N2Oemissionfluxinalafalfafieldwithdifferentgrowthyears测定期内各处理N2O排放通量如图3-1所示，各处理的变化趋势基本一致，总体呈现出“夏秋季高，春冬季低”的季节变化规律。测定初期（2018年3月）此时苜蓿进入返青期，土壤表现为N2O吸收态，排放通量约为-0.00817～-0.01908mg·m-2·h-1之后随着土壤温度回升，降水量增加，各处理均由N2O吸收态转变为N2O排放态。并于2018年苜蓿第二茬再生期（7月15日）达到排放峰值，此时L2003处理N2O排放速率最高，为0.1679mg·m-2·h-1，其次为L2005处理，为0.1514mg·m-2·h-1，L2012处理N2O排放速率最低，为0.1448mg·m-2·h-1。7月中旬开始N2O排放速率逐渐降低。苜蓿收获后的休闲期，各处理N2O均由排放态转变为吸收态，随着土壤温度浓度的降低，其吸收速率逐渐增加，并于2019年1月达到吸收峰值，此时L2012处理N2O吸收速率最大，为0.0413mg·m-2·h-1，其次为L2005，约为0.0365mg·m-2·h-1，L2003处理的N2O吸收速率最小，为0.0323mg·m-2·h-1，此后各处理N2O吸收速率逐渐降低，并于2019年苜蓿头茬返青期（3月底）由吸收态转变为排放态。在2019年4月-10月苜蓿整个生育期，各处理N2O排放趋势与2018年基本一致。从苜蓿返青期开始，N2O排放通量逐渐增加，至苜蓿第二茬再生期达到峰值，之后随着土壤温度逐渐下降，降雨量减小，N2O排放通量开始逐渐降低。综合2018年-2019年整个测定期来看，随苜蓿种植时间的延长，N2O排放速率增加。3.1.2N2O累积排放量和增温潜势不同种植年限苜蓿土壤N2O累积排放量和增温潜势如表3-1所示。N2O累积排放量随着苜蓿种植年限延长呈现增加趋势，其中L2003处理累积排放量比L2005和L2012处理分别增加了4.47%和14.14%，差异达到显著水平（P<0.05）。从增温潜势来看，N2O增温潜势随苜蓿种植年限的延长亦表现为增加的趋势，且处理间差异显著（P<0.05）。表3-1不同种植年限苜蓿土壤N2O累积排放量及增温潜势Table3-1N2OAccumulativeemissionsandwarmingpotentialinalafalfafieldwithdifferentgrowthyears3.2土壤理化性质对苜蓿种植年限的响应3.2.1土壤水分对苜蓿种植年限的响应图3-2不同种植年限苜蓿土壤含水量Fig.3-2Soilmoistureinalfalfafieldwithdifferentgrowthyears不同种植年限苜蓿地土壤含水量如图3-2所示.各种植年限苜蓿地土壤水分从2018年苜蓿头茬返青期（3月24日）开始各种植年限苜蓿土壤表层含水量逐渐下降，于2018年苜蓿头茬盛花期（5月20日）降至最低值，此时含水量约为7.0%，从2018年苜蓿头茬盛花期到头茬收获期（5月20日至6月20日），土壤含水量均保持在7.0%左右，基本趋于平稳，从头茬收获期开始（6月20日）逐渐上升，于2018年二茬返青期（7月15日）达到第一个峰值，此时L2003处理土壤含水量最高，为18.3%，其次为L2005处理，为18.0%，L2012处理土壤含水量最低，为17.1%，从2018年二茬再生期（7月15日）开始逐渐下降至7月下旬后又开始逐渐上升，并于8月中旬达到第二个峰值，此时L2003处理含水量最高，为19.6%，其次为L2005处理，为19.1%，L2012处理土壤含水量最低，为17.8%，之后各处理含水量开始迅速下降，于2018年二茬盛花期（9月14日）达到谷底，之后各处理土壤水分稍有回升后又逐渐下降，于2018年二茬收获后（10月30日）降至最低值，之后各处理土壤含水量又有所上升，此后由于进入冬季，各处理土壤水分波动不大。于2019年苜蓿头茬返青期（3月26日）开始，各处理土壤含水量开始下降，在201