(45)-7.3.1蛋白质芯片与芯片实验室

第三节蛋白质芯片（proteinchip）1一、蛋白质芯片的原理对固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的蛋白分子产物固定其上（如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等），根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白（存在于血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等），经洗涤、纯化，再进行确认和生化分析。2一、蛋白质芯片的原理蛋白质芯片是一种高通量的蛋白功能分析技术，可用于蛋白质表达谱分析，研究蛋白质与蛋白质的相互作用，甚至DNA-蛋白质、RNA-蛋白质的相互作用，筛选药物作用的蛋白靶点等，用以获得重要生命信息（如未知蛋白组分、序列；体内表达水平生物学功能、与其他分子的相互调控关系、药物筛选、药物靶位的选择等）345分类蛋白质功能芯片蛋白质检测芯片6正向蛋白质芯片反向蛋白质芯片蛋白质检测芯片Analyticalproteinmicroarray类似于较早出现的基因芯片，即在固相支持物表面高度密集排列的特性性配体点阵，当待测靶蛋白与其反应时，可特异性的捕获样品中的靶蛋白，然后通过检测系统进行分析7蛋白质功能芯片Functionalproteinmicroarray主要用于功能研究，寻找与拟研究蛋白质相互作用的蛋白质、小分子，或者寻找对蛋白质进行修饰的修饰酶，以及寻找酶的底物等89检测蛋白质芯片正向蛋白质芯片：样品与正相蛋白质检测芯片表面的抗体阵列进行温育来进行多个样品的分析反向蛋白质芯片：先将不同的样品在芯片表面进行点样，然后用大量的探针检测是否有目标蛋白质1011二、蛋白质芯片技术12（一）芯片制备固相载体：玻片、硅、云母及各种膜片等；理想的裁体表面是渗透滤膜（如硝酸纤维素膜）或包被了不同试剂（如多聚赖氨酸）的载玻片13（一）芯片制备探针：特定的抗原、抗体、酶、吸水或疏水物质、结合某些阳离子或阴离子的化学集团、受体和免疫复合物等具有生物活性的蛋白质。14制备时常常采用直接点样法，以避免蛋白质的空间结构改变，保持它和样品的特异性结合能力15（二）标本制备样品前处理可简化，甚至可直接利用生物材料(血样、尿样、细胞及组织等)进行检测样品预处理：制备一、二级抗体，荧光标记16（三）杂交结果与分析1.生物分子反应使用时将待检的含有蛋白质的标本如尿液、血清、精液、组织提取物等，按一定程序做好层析、电泳、色谱等前处理，然后在每个芯片池里点入需要的种类根据测定目的不同可选用不同探针结合或与其中含有的生物制剂相互作用一段时间，然后洗去未结合的或多余的物质，将样品固定一下等待检测即可17（三）杂交结果与分析2.信号的检测及分析直接检测模式是将待测蛋白用荧光素或同位素标记，结合到芯片的蛋白质就会发出特定的信号，检测时用特殊的芯片扫描仪扫描和相应的计算机软件进行数据分析，或将芯片放射显影后再选用相应的软件进行数据分析18（三）杂交结果与分析2.信号的检测及分析间接检测模式类似于ELISA方法，标记第二抗体分子以上两种检测模式均基于阵列为基础的芯片检测技术。该法操作简单、成本低廉，可以在单一测量时间内完成多次重复性测量19（三）杂交结果与分析2.信号的检测及分析国外多采用质谱(massspectrometry．MS）分析基础上的新技术，如表面加强的激光离子解析一飞行时间质谱技术（SELDI-TOF-MS），可使吸附在蛋白质芯片上的靶蛋白离子化，在电场力的作用下计算出其质量电荷比，与蛋白质数据库配合使用，来确定蛋白质片段的分子量和相对含量，可用来进行检测蛋白质谱的变化光学蛋白芯片技术是基于1995年提出的光学椭圆生物传感器的概念。利用具有生物活性的的芯片上靶蛋白感应表面及生物分子的特异性结合性，可在椭偏光学成像观察下直接测定多种生物分子2021三、蛋白质芯片在医学中的应用22（一）疾病发病机制的研究高通量、全景式对疾病的分子机制进行研究，能剖析疾病发生的分子基础，使临床医生能够从疾病的成因而不是以其症状进行诊断23（二）疾病的诊断蛋白质芯片能够同时检测生物样品中与某种疾病或者环境因素损伤可能相关的全部蛋白质的含量情况发现有些蛋白质的表达，给肿瘤等疾病的诊断和治疗带来了新途径24（三）药物筛选及新药的研制开发疾病的发生发展与某些蛋白质的变化有关，如果以这些蛋白质构筑芯片，对众多候选化学药物进行筛选，直接筛选出与靶蛋白作用的化学药物，将大大推进药物的开发有助于了解药物与其效应蛋白的相互作用，并可以在对化学药物作用机制不甚了解的情况下直接研究蛋白质谱可以将化学药物作用与疾病联系起来，以及药物是否具有毒副作用、判定药物的治疗效果，为指导临床用药提供实验依据。25（四）特异性抗原抗体的检测蛋白质芯片上的抗原抗体反应体现出很好的特异性，根据抗原抗体的特异性结合检测来度量整个细胞或组织中的蛋白质的丰富程度和修饰程度利用蛋白质芯片技术，根据与某一蛋白质的多种组分亲和的特征，筛选某一抗原的未知抗体，将常规的免疫分析微缩到芯片上进行，使免疫检测更加方便快捷2627AbMicroarrayClontech™抗体芯片AbMicroarray380（五）生化反应的检测对酶活性的测定一直是临床生化检验中不可缺少的部分酶作为一种特殊的蛋白质，可以用蛋白质芯片来研究酶的底物、激活剂、抑制剂等28第四节芯片实验室29一、芯片实验室的概念芯片实验室（Lab-on-a-chip）或称微全分析系统（MicroTotalAnalysisSystem，ormicroTAS）是指把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、生物与化学反应、分离检测等基本操作单位集成或基本集成于一块几平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种技术。3031一、芯片实验室的概念通过分析化学、微机电加工（MEMS）、计算机、电子学、材料科学与生物学、医学和工程学等交叉来实现化学分析检测即实现从试样处理到检测的整体微型化、自动化、集成化与便携化这一目标。提高分析速度,增加分析效率,减少样本和试剂的消耗,排除人为干扰,防止污染以及完成自动高效的重复实验。分析系统的微型化可以使野外实验室变得很简单32二、芯片实验室的原理非流动的静态微型实验系统例如传统定义中的生物芯片，如基因芯片,蛋白质芯片等。这类芯片一般通过检测点阵上的不同反应(如杂交或者蛋白相互作用等)来进行分析,功能较为有限33微阵列芯片(Microarraychip)二、芯片实验室的原理2.微流控芯片（Microfluidics）用类似半导体的微机电加工技术在芯片上构建微流路系统,将实验与分析过程转载到由彼此联系的路径和液相小室组成的芯片结构上加载生物样品和反应液后,采用微机械泵、电水力泵和电渗流等方法驱动芯片中缓冲液的流动,形成微流路,于芯片上进行一种或连续多种的反应34二、芯片实验室的原理2.微流控芯片（Microfluidics）激光诱导荧光、电化学和化学等多种检测系统以及与质谱等分析手段结合的很多检测手段已经被用在微流控芯片中,对样品进行快速、准确和高通量分析微流控芯片的最大特点是在一个芯片上可以形成多功能集成体系和数目众多的复合体系的分析系统353637发展历程：1990年，瑞士的Manz首次提出微流控芯片的概念。厚度：<5mm，面积：几平方厘米-十几平方厘米1994年，美国橡树岭国家实验室改进了芯片毛细管电泳的进样方法。1995年，美国加州大学在微流控芯片上实现了DNA的测序。1996年，PCR技术与毛细管电泳相结合。Caliper公司是首家微流控芯片公司。Agilient公司与Caliper公司联合推出了生化分析仪2100.三、芯片实验室技术38芯片实验室的基底材料芯片材料:化学相容性,电渗流,绝缘性,散热性及制作工艺性等.最早的芯片实验室是构建在硅片上的,但是硅导电性太强,生物兼容性不好石英基片的微细加工技术与硅片类似,可以耐高压,生物兼容性好,而且完全透明,便于检测,但成本较高39芯片实验室的基底材料高分子聚合物对生物和化学样品具有相容性,容易获得高深宽比的微结构,具有能可逆和重复变形而不发生永久性破坏的特点,能透过300nm以上的紫外光和可见光,具有一定的化学惰性,无毒,价廉等优点.批量生产成本低,更适合于一次性使用当制作普通电泳芯片时,可选用软化温度较低的材料,如有机玻璃或聚苯乙烯;制作PCR与毛细管电泳集成芯片时,可选用软化温度较高的材料,如聚碳酸脂、聚丙烯、聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)和聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate,PMMA)40芯片实验室的加工工艺紫外光刻是早期硅片加工中使用最为广泛的微细加工技术,工艺过程通常包括:掩蔽膜生长,涂光刻胶,紫外曝光,显影(定影),腐蚀,去除光刻胶等软刻蚀技术包括微接触印刷,毛细微模塑,溶剂辅助的微模塑,转移微模塑,近场光刻蚀等

41芯片实验室的加工工艺LIGA(Lithographie,Galvanoformung,Abformung)技术在制作非硅基微结构上具有巨大的潜力.该工艺最大的优点是能够得到厚而扁平的结构.LIGA工艺可以获得大于100的深宽比,很好地满足了微流体沟道的制作工艺要求DEM(Deepetching,Electro{orming,MicrorepJication)技术进行非硅材料三维微机械加工,吸收了体

硅微加工技术和LIGA技术的优点,解决了LIGA技术需要同步辐射光源的问题,利用该技术可对非硅

材料,如金属,聚合物或陶瓷进行三维微加工,其加工深宽比大于20微机械滑刻法制作的毛细管电泳芯片具有制造成本低,工艺流程的简单,易于大批量生产等优点,为芯片试验室的实用化以及批量化生产奠定了坚实的基础42微流体的驱动微流体的驱动与控制和宏观流体的驱动与控制有很大的不同，这主要是由于尺度减小，流体的流动特性发生了变化。这种流动特性的变化使得宏观流体驱动与控制技术在微流体中的简单移植往往不成功或者效果不好，微流体的驱动与控制技术更为复杂化和多样化微流体的驱动和控制技术种类很多，可分为电渗驱动、压力驱动、电水力驱动、表面张力驱动等43芯片实验室常用的检测手段光学检测荧光检测：最灵敏,具有良好的选择性和较宽的线性范围,并且许多如氨基酸,DNA等重要的生化物质样品均可用荧光试剂进行标记,是目前用较多的检测方法吸收光度检测

：可测定物质种类多,仪器结构较简单等优点.