基因工程操作的程序

基因工程操作的程序第1页，共55页，2023年，2月20日，星期四识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。主要是从原核生物中分离纯化出来的一种酶。能将外来的DNA切断，由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性核酸内切酶。4000种。1、来源：2、种类：3、作用：4、结果：形成两种末端一、“分子手术刀”——限制性核酸内切酶粘性末端平末端第2页，共55页，2023年，2月20日，星期四

大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。限制酶什么叫黏性末端？第3页，共55页，2023年，2月20日，星期四限制酶什么叫黏性末端？第4页，共55页，2023年，2月20日，星期四什么叫黏性末端？

被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。第5页，共55页，2023年，2月20日，星期四什么叫平末端？

当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。第6页，共55页，2023年，2月20日，星期四第7页，共55页，2023年，2月20日，星期四限制酶所识别的序列有什么特点？限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线,中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。图1-1限制酶识别序列的中心轴线第8页，共55页，2023年，2月20日，星期四二、“分子缝合针”——DNA连接酶1、种类：2、作用部位：E·coliDNA连接酶:T4DNA连接酶:

磷酸二酯键

DNA连接酶可把两个DNA片段之间的缝隙“缝合”起来，这样一个重组的DNA分子就形成了。只能连接黏性末端连接黏性末端和平末端第9页，共55页，2023年，2月20日，星期四T磷酸二酯键1234512345A第10页，共55页，2023年，2月20日，星期四第11页，共55页，2023年，2月20日，星期四右图示某DNA片段，有关该图的叙述中，不正确的是A．②③④可形成DNA的基本组成单位B．②③④构成的结构在DNA中特定排列顺序可代表遗传信息C．某限制性内切酶可选择⑦作为切点D．DNA连接酶可连接①处断裂的化学键C第12页，共55页，2023年，2月20日，星期四第13页，共55页，2023年，2月20日，星期四DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？答：不是一回事。基因工程中所用的连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为E·coli连接酶。另一种是从T4噬菌体中分离得到，称为T4连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口（nick），而不能连接单链DNA。DNA连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯键（在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与5位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成），那么，二者的差别主要表现在什么地方呢？第14页，共55页，2023年，2月20日，星期四（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的末端上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。（2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。第15页，共55页，2023年，2月20日，星期四三、“分子运输车”—基因进入受体细胞的载体：第16页，共55页，2023年，2月20日，星期四第17页，共55页，2023年，2月20日，星期四第18页，共55页，2023年，2月20日，星期四§1.2基因工程的基本操作程序第19页，共55页，2023年，2月20日，星期四补：原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。

转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。

转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。第20页，共55页，2023年，2月20日，星期四①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质。：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质编码区非编码区原核细胞的基因结构②有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。启动子第21页，共55页，2023年，2月20日，星期四补：真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子终止子编码区上游编码区下游内含子：外显子：第22页，共55页，2023年，2月20日，星期四真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA

聚合酶结合位点。非编码序列：包括非编码区和内含子第23页，共55页，2023年，2月20日，星期四原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码第24页，共55页，2023年，2月20日，星期四基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定第25页，共55页，2023年，2月20日，星期四一、目的基因的获取1、目的基因主要是指______________________编码蛋白质的基因请举出三个以上的例子2、获取目的基因的常用方法有哪些?（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成第26页，共55页，2023年，2月20日，星期四(一)从基因文库中获取目的基因

将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库基因文库

基因组文库部分基因文库（如:cDNA文库）1.基因文库第27页，共55页，2023年，2月20日，星期四基因组文库与部分基因文库的关系第28页，共55页，2023年，2月20日，星期四2.基因文库的构建方法①鸟枪法：供体细胞中的DNA许多DNA片段运载体限制酶与载体连接载入受体细胞产生特定性状导入外源DNA扩增目的基因分离(直接分离法)(一)从基因文库中获取目的基因第29页，共55页，2023年，2月20日，星期四②反转录法：

以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。目的基因的mRNA杂交双链(单链RNA/单链DNA)单链DNA反转录酶核酸酶H2.基因文库的构建方法DNA聚合酶双链DNA(目的基因)(cDNA)第30页，共55页，2023年，2月20日，星期四③根据已知的氨基酸序列合成DNA法：

根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成2.基因文库的构建方法第31页，共55页，2023年，2月20日，星期四上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点缺点鸟枪法反转录法根据已知氨基酸合成DNA法操作简便广泛使用工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因专一性强操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高专一性最强仅限于合成核苷酸对较少的简单基因思考:为什么要构建基因文库?直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗?第32页，共55页，2023年，2月20日，星期四①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③条件：_______________________、

_______________、___________(做启动子)、___________.前提条件：②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸一对引物DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增(二)利用PCR技术扩增目的基因有一段已知目的基因的核苷酸序列第33页，共55页，2023年，2月20日，星期四PCR三步曲

预变性保温变性90~95℃延伸70~75℃退火55~60℃第34页，共55页，2023年，2月20日，星期四PCR反应参数：

变性94℃20s退火52℃20s延伸72℃20s

预变性94℃30s

保温72℃30s循环次数30第35页，共55页，2023年，2月20日，星期四⑥过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链第36页，共55页，2023年，2月20日，星期四(二)利用PCR技术扩增目的基因第37页，共55页，2023年，2月20日，星期四PCR反应的特点特异性强灵敏度高完全自动化标本纯度要求低第38页，共55页，2023年，2月20日，星期四

PCR仪的介绍中学专用PCR仪科研用PCR仪第39页，共55页，2023年，2月20日，星期四

中学专用PCR仪是我公司根据生物新课标要求，结合中学教学特点研制而成的。本产品也是经过教仪所专家质检认证的，专门为中学教学而设计，与科研用仪器相比具有许多优点：

1.操作简便，实验直观

2.PCR原理完整展现

3.彩色大屏幕，中文菜单，便于学习加深理解第40页，共55页，2023年，2月20日，星期四1.用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。2.用_____________切断目的基因，使其产生_________________。(二)基因表达载体的构建——

核心3.将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组

DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同第41页，共55页，2023年，2月20日，星期四质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）——

核心同一种(二)基因表达载体的构建4.过程:第42页，共55页，2023年，2月20日，星期四5.基因表达载体的组成：复制原点+启动子+目的基因+终止子+标记基因它们有什么作用？第43页，共55页，2023年，2月20日，星期四(三)将目的基因导入受体细胞转化——目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达第44页，共55页，2023年，2月20日，星期四1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法（1）农杆菌介绍（2）原理及适用范围(双子叶植物和裸子植物)(三)将目的基因导入受体细胞第45页，共55页，2023年，2月20日，星期四(三)将目的基因导入受体细胞转化方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞第46页，共55页，2023年，2月20日，星期四2、将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法（2）程序：(三)将目的基因导入受体细胞3、将目的基因导入微生物细胞（1）思考：为什么选用微生物作为受体细胞？（2）方法：第47页，共55页，2023年，2月20日，星期四(四)目的基因的检测与鉴定——检查是否成功检测—鉴定——①检测转基因生物染色体的DNA

上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法——方法——方法——DNA分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）抗原抗体杂交第48页，共55页，2023年，2月20日，星期四DNA分子杂交示意图

采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。第49页，共55页，2023年，2月20日，星期四小结基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有专一性(识别序列)切开DNA分子的磷酸二酯键DNA连接酶连接磷酸二酯键种类E.coliDNA连接酶T4

DNA连接酶运载工具具备的条件结构简单,大小适中能在宿主细胞中自我复制并稳定存在具一个多个限制酶切位点具标记基因质粒、λ噬菌体衍生物、动植物病毒第50页，共55页，2023年，2月20日，星期四1）以下说法正确的是（）

A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列

B、质粒是基因工程中唯一的运载体

C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接

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