基因工程原理

基因工程原理第1页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering本章内容1基因工程的历史和发展2基因工程的基本内容和技术3基因工程相关酶学4基因工程中的载体和宿主系统5目的基因的获得和分离方法6外源基因导入宿主细胞7重组体的鉴定和分析8外源基因在大肠杆菌中的表达9外源基因在真核细胞中的表达10蛋白质工程11基因工程的应用和展望第2页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering将外源基因在特定的宿主细胞中表达，获得基因的产物——蛋白质，这才是基因工程的目的所在目前用于外源基因表达的宿主细胞有原核的，也有真核的；有植物细胞也有动物细胞；也有利用整个生物体作为外源基因表达的宿主的；他们各有特点，分别在不同的情况下使用。8外源基因的表达第3页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering与外源基因表达有关的几个重要概念启动子核糖体结合位点终止信号融合蛋白与非融合蛋白包涵体第4页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering选用强的启动子可以使基因处于高水平表达。原核细胞中表达外源基因常用的强启动子有（1）lacUV5，即乳糖操纵子的启动子，但是经过了改造，活性无须cAMP活化，被阻遏蛋白laci关闭，可以被IPTG诱导。（2）tac启动子，由trp启动子的-35区和lac启动子的-10区融合而成，可被IPTG诱导。基因表达控制元件1---启动子第5页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering（3）λPL或PR启动子受λ阻遏蛋白调节，温度敏感型突变体（λCIts857）在30℃时启动子处于阻遏状态，在超过40℃时阻遏蛋白失活，基因得到表达。（4）ompF是低渗透压外膜蛋白基因的启动子，其温度敏感突变体在低温时无活性，温度升高有活性；（5）噬菌体T7的启动子，可以被T7RNA聚合酶高效特异识别并、高效转录，常用于构建高效表达系统或体外转录系统。第6页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering基因表达控制元件2----核糖体结合位点大肠杆菌的核糖体结合位点是一段长3-9个核苷酸，富含嘌呤的序列，位于起始密码子上游3-11个核苷酸处。称为SD序列。mRNA的翻译效率受SD序列与16SrRNA3’端互补程度的影响，还受到SD序列与起始密码子之间的距离以及起始密码子上下游序列的影响。第7页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering基因表达控制元件3---终止信号在UAAUAGUGA三个终止信号中，UAA的终止信号作用最强。第8页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering外源基因的表达---融合蛋白质和非融合蛋白质外源基因直接在宿主细胞中表达，产物就是非融合蛋白质。但是有时候因为某种原因，外源基因不能直接在宿主细胞中表达，需要在外源基因的5’端（或3‘端）接上一段宿主细胞或其他来源的基因片段才能在细胞中表达，这样表达出来的蛋白质的多肽链就是一个融合蛋白质。第9页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering融合蛋白质由两个部分组成，N端的序列是目的基因之外的其他基因的产物，目的基因的表达产物位于C端。融合蛋白质分离后，利用特殊的试剂（如溴化氰）或特异的蛋白质水解酶（如胰蛋白酶）将两个部分分开，除去N端部分的序列，就可以得到目的基因的产物。第10页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering（1）外源基因的活性形式中第一个氨基酸可能不是蛋氨酸，基因表达时需要在基因前面加入起始密码子，但是这种融合蛋白质可能会影响到其活性。（2）外源基因在宿主细胞中的表达量较低，融合蛋白质可以增加外源基因产物的表达量。（3）外源基因表达的蛋白质在宿主细胞内不稳定，易于被宿主的蛋白酶降解，融合的蛋白可以增加其稳定性。（4）融合蛋白质不影响某些抗体表位，可以容易进行抗体工程。（5）与某些特异的多肽或蛋白质融和，易于在分离后迅速纯化和检测。外源基因不能直接在宿主细胞内表达的情况：第11页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering分泌蛋白原核生物和真核生物的分泌蛋白质的N端都有一段信号肽，可以引导新合成的多肽链穿过细胞膜，信号肽酶将信号肽切除。利用这种机制，将欲表达的蛋白的基因与信号肽基因序列融合形成融合蛋白，蛋白表达出来后就被分泌到细胞外或培养基中。对于蛋白质的分离是非常方便的。第12页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering包涵体可以将细胞破壁和离心而收集，再经过溶解和复性有可能得到有活性的蛋白。不同蛋白的复性条件不同。包涵体由于基因表达部位低电势以及外源蛋白分子特殊结构,低电荷,无糖基化等,使得外源蛋白与周围的杂蛋白或核酸等形成不溶解的聚合物,叫做包涵体。包涵体的形成与许多因素有关。包涵体中的蛋白是没有生物活性的,在一定条件下,有些包涵体中的蛋白可以被“复性”,重新具有正常的蛋白活性.不同包涵体中蛋白的复性条件不同。第13页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering大肠杆菌生长迅速，容易繁殖，已经成为应用最为广泛的基因表达宿主细胞。虽然真核基因在大肠杆菌中表达会遇到许多困难，但是经过几十年的发展，大肠杆菌中表达真核基因的数目还在增加，许多以前遇到的困难已经得到较好的解决。外源基因在大肠杆菌中表达的策略第14页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering在大肠杆菌中外源基因高效表达的策略（1）表达载体的优化表达载体除了具有一般表达载体的基本元件外，还应该注意他们之间的优化。如启动子的有效性与高效性，终止密码子的有效性，SD序列与起始密码子之间的距离等，另外使用高拷贝质粒有利于外源基因的高表达。基因工程中外源基因的高效表达是许多因素综合作用的结果。第15页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering（2）影响基因的转录的因素a启动子的强弱是控制外源基因表达效率的关键因素之一b基因的阻遏子载体中的阻遏基因应该是能够调控的，这样可以选择基因表达的最佳时机c原核增强子样序列可以增强启动子的基因转录效率d转录终止子第16页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering（3）影响翻译水平的因素近来发现，基因转录后的调控是影响水平的更重要的因素。a基因与核糖体的结合部位的调控——基因的SD序列、SD序列与起始密码子之间的距离以及密码子的偏爱性b基因翻译起始区二级结构对翻译起始的影响——提高翻译的起始效率和mRNA的稳定性第17页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering（4）影响蛋白质水平的因素防止蛋白质翻译出来之后被降解以及将蛋白质分泌到细胞外等。（5）其他因素如菌种、培养基条件、细菌的生长条件等。第18页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering真核基因在大肠杆菌中表达可能会遇到的一些困难a原核细胞的RNA转录酶不能识别真核细胞的启动子b真核细胞的基因前面没有SD序列。c真核基因含有内含子，原核细胞没有d原核细胞内没有真核细胞的蛋白翻译后的修饰体系，如二硫键的形成，糖基化，磷酸化等。e真核蛋白会被原核细胞作为外源蛋白而降解f真核蛋白前面有信号肽，原核细胞内不能正确切除，导致不能形成正确的蛋白结构，形成没有生物学活性的蛋白包含体结构。第19页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering9外源基因在真核细胞中的表达为了便于操作，一般在真核细胞中表达使用的表达载体都具有在原核细胞中生长的复制起点，因此，均属于穿梭质粒。第20页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering酵母细胞是研究最为清楚的真核细胞，有“真核细胞中的大肠杆菌”之称。1996年基因组序列测定完毕。在真核生物的基因工程中是首选的宿主细胞。优点a是单细胞生物，操作简单，易于生长。b具有真核细胞对蛋白质的加工翻译体系，表达产物与天然蛋白类似（1）在酵母细胞中的表达第21页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering用于酵母中生长的基因克隆载体常用的有五类：整合质粒（YIP），附加体质粒（YEP），复制质粒（YRP），有着丝粒的质粒（YCP），酵母人工染色体（YAC）。常用的宿主有：常规表达酵母：酿酒酵母、栗酒裂殖酵母非常规表达酵母：巴斯德毕赤酵母、汉逊多型酵母第22页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering目前应用酿酒酵母表达体系表达了许多外源基因，如乙型肝炎疫苗、人胰岛素、人粒细胞集落刺激因子等。但是酿酒酵母在发酵过程中会产生乙醇，对蛋白质会过度糖基化，合成的蛋白质的分泌能力有限等。酵母表达系统的应用第23页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering巴斯德毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母。甲醇可以诱导细胞中与甲醇代谢有关的酶的高效表达。其中一种酶叫做乙醇氧化酶，启动子AOX1是一种可诱导的强启动子。利用它可以高水平表达外源基因。这种酵母的分泌能力比酿酒酵母强，但是这种酵母的遗传背景了解的还不清楚，遗传改造难度较大。目前已经有几十种外源基因获得表达，如乙型肝炎表面抗原、人肿瘤坏死因子、人表皮生长因子和链激酶等。第24页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering根癌土壤农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）可以诱发裸子植物和双叶植物产生根瘤的细菌。其中分离到的Ti质粒，具有诱发植物产生肿瘤的作用。将外源基因插入到质粒的特定的区域，再转化植物即可将外源基因转化到植物的染色体上，从而获得转基因植物。但是Ti质粒太大，有两种解决办法：利用共整和载体或构建二元载体系统。另外用于植物转化的载体来自经过改造的发根土壤农杆菌的产生根毛的质粒Ri以及各种植物病毒（花椰菜花叶病毒）等。（2）外源基因在植物细胞中的表达第25页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering在哺乳动物中使用的表达载体一般都是由动物病毒载体改造而成，如SV40、逆转录病毒、腺病毒等。载体中的元件包括：原核生物的复制起点和选择标记、真核生物的表达控制元件、真核细胞中的复制和选择的遗传因子等。（3）外源基因在哺乳动物细胞中的表达第26页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering目前逆转录病毒因为高效感染和整合而倍受关注，发展成为基因工程中的重要载体。但只能感染正在分裂的细胞，腺病毒可以容纳更大的外源基因，并且可以感染非分裂的细胞；痘病毒可以用于构建工程疫苗。各种病毒载体各有其特点和特殊用途。第27页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering10蛋白质工程（proteinengineering）在基因工程中人们发现，生物体的许多天然蛋白质对于人们的产业化等开发不合适，必需对他们进行改造。美国基因公司的Ulmer在1983年首次提出蛋白质工程这个概念，自此之后，蛋白质工程迅速发展，已经成为生物工程的重要组成部分。第28页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering蛋白质工程是指通过蛋白质化学、蛋白质晶体学和动力学的研究获取有关蛋白质的物理化学各方面的信息，在此基础上对编码该蛋白质的基因进行有目的的改造，并通过基因工程等手段对其进行表达和分离纯化，最终投入应用。第29页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering蛋白质工程的发展是许多学科相互融合、共同努力的结果。如生物物理学、生物化学、分子生物学、计算机科学和化学工程学等。蛋白质工程首先必需积累成千上万蛋白质的一级结构和高级结构的数据，找出蛋白质分子之间的进化关系、一级结构和高级结构之间的关系、结构与功能之间的关系等规律。尤其是计算机科学和图象显示技术的的发展，已经使得蛋白质的结构分析、三维结构预测和模型建立，分子设计和能量计算等理论和技术以及相关软件，正在发展成为生物信息学的一门分支。在蛋白质工程的定向改造的分子设计中是不可缺少的。10.1蛋白质分子的设计和改造第30页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering采用分子生物学的方法，也可以推测出一些未知蛋白质的结构和功能，采用定位诱变技术对基因改造的结果可以为分子改造提供新的设计方案。蛋白质工程实际上是对生物进化的模拟，按照蛋白质形成的规律，改造蛋白质或构建新的蛋白质。第31页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering蛋白质工程可以说是新一代的基因工程。一般首先经过周密的分子设计，然后依靠基因工程获得突变型的蛋白质（mutein），以检验是否达到了预期的效果，如果改造的结果不理想，还需要重新设计再次改造，往往要经过多次实践摸索才能达到改进蛋白质性能的预定目标。第32页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering10.2蛋白质的实验进化

蛋白质的分子设计和结构改造在技术上取得重大突破后，备受各界关注，十多年来发展极为迅速，取得了一系列重要成果。然而，这些成果多数属子理论上的，或是技术上的，获得改进性能的实用蛋白质并不多。其主要原因在于分子设计的不精确性。第33页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering分子设计的主要依据来自三个方面关系的知识：①蛋白质分子间的进化关系，从同源蛋白质序列的微观差异可找出其对空间结构和生物功能的影响：另一方面蛋白质的进化研究也为蛋白质的构造规则提供了信息。②蛋白质一级结构与空间结构的关系，由此可以从一级结构预测三级结构。③蛋白质结构与功能的关系，找出结构改变对功能的影响。第34页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering从已知蛋白质的上述关系可用以推测一级结构的改变对空间结构和生物功能可能的影响，而目前对蛋白质结构规律的认识还十分有限，这种推测也就并不可靠，往往差之毫厘，失之千里。于是蛋白质改造的另一途径即在实验室条件下模拟生物分子的进化，通过随机变异和靶功能的选择，多次重复，从而获得改进性能的蛋白质。此过程称为实验进化。第35页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering蛋白质实验室进化基本过程正常基因变异的基因淘汰有害突变，保留有益突变筛选引入突变使用无校对功能的DNA聚合酶DNA改组---DNA随机片段化，自身引发PCR，重组合PCR噬菌体表面展示技术亲和选择等第36页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering10.3蛋白质工程的进展目前蛋白质工程更多侧重于对蛋白质的理论研究，并已成为常用的不可或缺的方法。对于蛋白质的研究，大致有以下几个方面：①有助于对蛋白质结构的解析，揭示蛋白质分子结构的规律，由一级结构预测空间结构。②确定蛋白质分子问的相互关系，找出相互作用的氨基酸残基。③阐明蛋白质结构与功能的关系．了解蛋白质的活性部位一和一级结构对生物功能的影响。第37页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering在应用方面，几乎所有类型具有开发前景的蛋白质和多肽都用蛋白质工程作过改造的尝试，并取得不同程度的成果。研究最多、取得成果最显著的是生物技术药物和工业用酶的蛋白质工程。蛋白质和多肽类药物包括激素、细胞因子、酶、酶的激活剂和抑制剂、受体和配体、细胞毒素和杀菌肽以及抗体等。作为药物，希望通过改造以提高其活性、特异性和稳定性，控制分子聚集，降低免疫原性和毒副反应．延长在体内的半衰期，增强对靶位点的导向性等。第38页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering水蛭素是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特异抑制剂，它有多种变异体，由65或66个氨基酸残基组成。水蛭素在临床上可作为抗栓药物用于治疗血栓疾病。为提高水蛭素活性，在综合各变异体结构特点的基础上提出改造水蛭素主要变异体HV2的设计方案，将47位的Asn变成Lys，使其与分子内Thr4或Asp5间形成氢键来帮助水蛭索N端肽段正确取向，从而提高抗凝血效率，试管试验提高达4倍．在动物模型上检验抗血栓形成的效果，提高20倍。第39页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering生长激素通过对它特异受体的作用促进细胞和机体的生长发育，然而它不仅可以结合生长激素受体，还可以结合许多种不同类型细胞的催乳激素受体，引起其他生理过程。在治疗过程中为减少副作用，需使人的重组生长激素(rh-GH)只与生长激素受体结合．尽可能减少与其他激素受体的结合。第40页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering经研究发现，二者受体结合区有一部分重叠，但并不完全相同，有可能通过改造加以区别。由于人的生长激素和催乳激素受体结合需要锌离子参与作用．而它与生长激素受体结合则无需锌离子，于是考虑取代充当锌离子配基的氨基酸侧链，如第18和21位的His和第174位的Glu。实验结果与预先设想一致，但要开发作为临床用药物还有大量研究工作要做。第41页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering组织型纤溶酶原激活刑(t-PA)和单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(scU-PA)是两种具有血纤维蛋白专一性的溶栓剂，可在血栓(血纤维蛋白)表面激活纤溶酶原，有效溶解血栓。但在临床治疗中大剂量使用的情况下二者的专一性均有限，仍可引起全身性纤溶酶原的激活而造成出血倾向。与u-PA相比，t-PA与纤溶酶原的亲和力较低．而与血纤维蛋白的亲和力较高；当血纤维蛋白与纤溶酶原结合形成复合物时与t-PA的亲和力就大为提高。第42页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering于是设想构建嵌合型溶栓剂，期望综合二者之长．即将t-PA的识别控制序列(1-263)与u-PA激活纤溶溶酶的蛋白酶序列(144-408)融合在一起，并删除内源性抑制剂作用位点的4个氨基酸残基(178—181)。第43页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering所得嵌合tu-PA同时获得了亲本t-PA的反应专一性和对血纤维蛋白的亲和性以及亲本u-PA的激活性质，并消除了内源抑制剂的抑制作用，体外溶栓能力较强，而血纤维蛋白原消耗较小。如果用识别血纤维蛋白或血小板表面糖蛋白的单链抗体与u-PA活性区融合，其嵌合分子对血栓的导向功能更强。第44页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering已经分离并进行生物化学研究的酶不下几千种，但是再工业生产中应用的酶只有几十种，可见工业用酶的开发潜力还很大。使用蛋白质工程的方法来提高酶的活性、特异性和稳定性，改变反应介质和动力学的性质，从而改进现有的工业用酶，开发更多的新的工业用酶。例如在去污剂种需要添加蛋白酶和脂酶，但是天然分离得到的酶一般达不到需要的耐热、耐碱、耐氧化剂等的性能，需要加以改造。第45页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering11基因工程的应用和展望11.1基因工程开辟了生物学研究的新纪元基因工程的新技术核新方法为解决生物化学、分子生物学核医学中的一些重大问题提供了强有力的手段。DNA序列的测定蛋白质序列的推测可以代替烦琐的蛋白质序列测定细胞内微量蛋白质的大量获得不再困难基因功能的研究，反向遗传学，反向生物学生物体全基因组序列的测定新的生物学领域的出现：结构分子生物学，神经分子生物学，发育分子生物学是目前发展最快的学科。第46页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering基因组时代与后基因组时代蛋白质组学的出现（1994年）XX组与XX组学不断出现的时代Gene--Genome—genomicsProtein---proteome--proteomicsRNA--RNomicsTranscription--transcriptomics第47页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering11.2基因工程促进了生物技术产业的兴起基因工程首先在医药核化工领域崭露头角，其实最大的用武之地是农业和医疗保健领域。（1）基因工程药物1977年Itakura和BoyerH利用当时刚趋成熟的基因工程技术，在大肠杆菌中产生下丘脑激素14肽生长素释放抑制激素，商品名Somatostatin(SMT)。该激素可用于治疗儿童发育时期因生长素分泌过多造成的四肢巨大症。从1L工程菌发酵液中可得到50mg的基因表达产物，相当于50万头羊下丘脑提取的该激素量，由此可以了解到基因工程产业化的意义。第48页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering其后，基因工程药物不断成功问世。1978年胰岛素原在大肠杆茵中表达成功。1979年人生长素基因在大肠杆菌中获得直接表达。1980年人白细胞干扰素基因获得克隆和表达。1981年抗口蹄疫的基因工程抗原研制成功。1982年乙肝抗原在酵母菌中表达成功。同年转基因植物和转基因动物也分别获得成功。第49页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering基因工程药物包括各类激素、酶、酶的激活剂抑制剂、受体和配体、细胞因子和调节肽、抗原和抗体等。细胞内微量的细胞因子由于采用基因工程手段大量制备，才有可能研究其生物学功能和临床应用价值。使用蛋白质工程设计出自然界不存在的新型蛋白质和多肽，意义更为重大。第50页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering利用基因工程生产的人类蛋白质药物尿激酶肿瘤坏死因子松弛素神经生长因子组织性纤溶酶原激活剂血清清蛋白淋巴细胞毒素白细胞介素干扰素胰岛素生长激素凝血因子VIII凝血因子IX红细胞生成素上皮生长因子降钙素促肾上腺皮质激素B细胞生长因子集落刺激因子绒毛膜促性腺激素生长激素释放因子巨噬细胞激活因子第51页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering使用基因工程手段可以做到定向给药（分子导向药物）第三代抗体的出现——抗体工程，使得抗体的获得不再需要免疫动物。第52页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering（2）基因工程在农业上的应用生物技术应用于农业，出现第二次“绿色革命”。农作物新品种的培育周期大大缩短农作物各种抗逆性的提高农作物的产量提高现代化的新型农业（无土农业）新型转基因家畜的出现，新品种的出现植物生物反应器第53页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering（3）基因治疗（genetherapy）就是向受体细胞内引入具有正常功能的基因，以纠正或补偿基因的缺陷，也可以利用引入的基因杀死体内病原菌或恶性细胞。一些以前无有效治疗手段的疾病，如遗传病、肿瘤、心脑血管疾病、老年痴呆、爱滋病等，有希望通过基因治疗来达到防治的目的。第54页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering1990年，美国正式开始首例临床基因治疗，患儿由于腺苷脱氨酶(ADA)基因缺陷，而患重度免疫缺陷症(SCID)。研究人员将克隆的腺苷脱氨酶基因(ada)导入患者淋巴细胞，经体外培养淋巴细胞可以产生腺苷脱氨酶，然后再将这种淋巴细胞转入患者体内，患者症状有明显缓解，治疗取得令人鼓舞的成功。美国之后，许多国家都开始了基因治疗试验。我国于1991年首例B型血友病基因治疗也获得满意结果。第55页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering然而目前基因治疗在技术上还未成熟，许多试验都没有成功。关键问题是：①如何选择有效的治疗基因。②如何构建安全载体，病毒载体效率较高，但却有潜在的危险性。③如何定向导入靶细胞，并获得高表达。人类基因组计划的完成必特有助于人类重要疾病基因的发现，基因治疗技术也在不断改进。根据乐观的估计，在今后20年中，基因治疗有可能取得重大突破，成为临床广泛采用的有效治疗手段第56页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering11.3基因工程的展望20世纪70年代初基因工程的出现带动了生物技术的兴起和发展，由此使生物科学进人了一个新的发展时期，其主要特点是：第一，生物科学得以前所未有的高速度向前发展。技术上的不断创新和突破，使得生物科学具有赖以迅猛发展的方法和手段。第二，生物科学与工程学相结合，出现空前规模大科学工程的研究。巨大的信息网将世界各实验室相连，生物科学的研究变得更有计划、更有组织、更有规模了。第57页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering第三，生物科学进入了一个创造和实践的新时代。如果说过去生物学主要是在认识生物的基础上研究怎样利用生物，那么今天已能够在分子水平上重新设计和创建自然界未曾出现过的基因、蛋白质和生物新品种。第58页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering基因工程和有关的生物技术为人类认识生命世界，认识人类自己提供了有效手段。（1）人类基因组计划与后基因组时代（2）生物的发育之谜，如何从一个受精卵发育成一成熟的个体？（3）人类的大脑活动规律之谜？第59页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering在基因工程的带动下，有关的生物技术得到迅速发展，构成了一个新兴的综合技术领域，它们运用生命科学和邻近基础学科的知识，并结合工程学的现代技术，成为巨大的生产力。一批以生物技术为基础的新产业群得以迅速兴起。这些产业能为社会提供大量商品和各种社会服务．创造出庞大的财富，其发展规模更是始料不及的。它们提供的商品或是生物技术药物、食品、化工产品、生物材料和加工制品，或是优良的生物品种。社会服务的含义也很宽，它们产生的直接效果是社会效益，如疾病诊断和医疗保健，水的净化和废物处理等。第60页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering新技术革命引起新的产业革命，促使世界产业迅速地朝向尖端技术化、知识密集化、高增殖价值化方向发生结构性的变化。领头产业正在更替。当今是信息经济时代，信息技术改变了整个社会面貌。任何经济形式都有始有终，都要经历形成、成长、成熟和转化四个明确的阶段。20世纪从电讯技术诞生、计算机出现、网络的形成到大规模使用芯片，信息经济进入了它的成熟阶段。据估计，再过20到30年．生物经济可能进人成熟阶段，并将取代目前的信息经济。到那时生物技术产业将会是领头的产业，生物技术会影响到经济结构、生活方式和社会的各个主要方面。第61页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering11.4基因工程的实例第62页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineeringGoldenRice第63页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering第64页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering第65页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering抗除草剂的烟草第66页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering抗虫棉花第67页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineeringWILT-PROOFFLOWERSEthylene,theplanthormonethatcausesfruittoripen,alsocausesflowerstowilt.ResearchersatPurduehavefoundthegenethatmakesflowerpetalsrespondtoethylenebywiltingandreplacedwithageneinsensitivetoethylene.Thetransgeniccarnationstheyproducedlastedfor3weeksaftercutting,whilenormalcarnationslastonly3days.不凋的康乃馨第68页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering第69页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineeringHERMANTHEWONDERBULLGenPharm,aCaliforniabiotechnologycompany,engineeredHerman,abullthatpossessesthegeneforhumanlactoferrin(HLF).HLFcon-fersantibacterialandirontransportpropertiestohumans.ManyofHerman’sfemaleoffspringnowproducemilkcontainingHLF,andGenPharmintendstobuildaherdoftransgeniccowsforthelarge-scalecommercialproductionofHLF.第70页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering第71页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineeringFirstClonedLitterInMarch2000,theresearchcompanythatfundedthecloningofDollythesheepannouncedthecloningoffivepigs:Millie,Christa,Alexis,Carrel,andDotcom.Researchersarehopefulthatclonedpigsmayonedayprovideorgansthatcanbetransplantedintohumanbeings.第72页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering染色体工程(chromosomeengineering)

染色体工程，就是按设计有计划削减、添加和代换同种或异种染色体的方法和技术。也称为染色体操作(chromosomemanipulation)

。第73页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering染色体工程一词，虽然在20世纪70年代初才提出，但早在20世纪30年代，美国西尔斯(E.R.Sears)等就已开始研究。它不仅在改良植物的遗传基础培育新品种上受到重视，而且也是基因定位，和染色体转移等基础研究的有效手段。第74页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering植物染色体工程的基本程序是人工杂交，细胞学鉴定，在杂种或杂种后代中筛选所需要的材料。以普通小麦为例，常用的材料如下：单体与缺体系统；三体系统；异附加系；异代换系；易位系。第75页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering用染色体工程获得的小麦附加天蓝冰草的异附加系抗秆锈和叶锈病；冰草染色体替代的小麦染色体的异代换系能抗15种秆锈病生理小种；有黑麦6R的小麦异代换系抗白粉病；还有小偃6号是具有两个偃麦草染色体的小麦易位系，能抗各种锈病、耐干热风、丰产，已在生产上大面积推广应用。表明染色体工程在培育抗病新品种上有重要意义。第76页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering第77页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering第78页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering第79页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering第80页，共88页，2023年，2月20日，星期四PrinciplesofGeneEngineering第三代基因工程------途径工程如果说，30年前主要用于基因克隆和表达的DNA重组技术属于第一代基因工程，20年前在基因水平对蛋白质的结构与功能进行局部修饰属于第二代基因工程，那