基因的重组与转移

基因的重组与转移第1页，共62页，2023年，2月20日，星期四外源DNA载体DNA重组分子原核细胞真核细胞扩增或表达表达连接转化或转导电穿孔或显微注射受体细胞第五章

基因的重组与转移

第2页，共62页，2023年，2月20日，星期四第3页，共62页，2023年，2月20日，星期四一、粘性末端的连接DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起。第一节

DNA片段的体外连接第4页，共62页，2023年，2月20日，星期四1.两段DNA的连接依靠粘性末端第5页，共62页，2023年，2月20日，星期四2.DNA片断与载体的连接依靠粘性末端第6页，共62页，2023年，2月20日，星期四第7页，共62页，2023年，2月20日，星期四ligasenick第8页，共62页，2023年，2月20日，星期四二、齐平末端（bluntend）的连接5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。1.直接连接T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’

3’

-OH-PP-HO-5’

3’

第9页，共62页，2023年，2月20日，星期四1972年，斯坦福大学的P.Labban和P.Kaiser提出。（1）同聚加尾

法

2.人工加尾形成

“粘性末端”

DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。①原理：分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。②加尾—碱基互补第10页，共62页，2023年，2月20日，星期四④缺点：③优点：能把任何片段连接起来不能把插入片段再切下来。非酶切位点第11页，共62页，2023年，2月20日，星期四用T4DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。（2）衔接物(linker)连接①linker用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：②linker的作用第12页，共62页，2023年，2月20日，星期四

第13页，共62页，2023年，2月20日，星期四

第14页，共62页，2023年，2月20日，星期四④缺点：1）可以用内切酶把插入片段切下来。如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段2）能给载体连接上Polylinker:③优点：第15页，共62页，2023年，2月20日，星期四（3）DNA接头

(adapter)连接法1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。5‘p-GATCCCGG-OH3’

GGCC-p5’

BamHIadapter用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。①adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。②adapter的作用第16页，共62页，2023年，2月20日，星期四Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC-p5’

BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’

5‘p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5’

接头自我连接第17页，共62页，2023年，2月20日，星期四第18页，共62页，2023年，2月20日，星期四接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。③优点：连上后就能用。④缺点：先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接。（以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）⑤防止自我连接第19页，共62页，2023年，2月20日，星期四5‘p-GATCCCGG-OHHO-GGCC-P

P-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5’

接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！

5‘GATCCCGG-OHHO-GGCC5’

5’CCGG-OHHO-GGCCCTAG5’

CIP处理-OHHO-第20页，共62页，2023年，2月20日，星期四Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC-p5’

BamHIadapterP--P

5‘GATCCCGG-HO-GGCC

CCGG-OH-GGCCCTAG5’

5’GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC5’

缺口缺口HO--OHCIP处理T4ligase虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接。第21页，共62页，2023年，2月20日，星期四三、PCR产物的连接1.在引物的5’端设计酶切位点符合载体的多克隆位点；（1）设计原则（2）带酶切位点的引物的结构3’端15~20bp与模板互补；5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列。（5’端多余的3~5bp属保护碱基）避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。第22页，共62页，2023年，2月20日，星期四引物1GCAGAATTC

互补序列模板EcoRI位点5’--3’

GCAGAATTC

互补序列5’--3’

3’

模板GCAGAATTC

互补序列

PCR产物5’--3’

3’

复性延伸模板模板3’

3’

第23页，共62页，2023年，2月20日，星期四GCTAGCCGG

互补序列模板BamHI位点-5’

3-’

5’

复性延伸模板模板3’

3’

GCTAGCCGG

互补序列-5’

3’-模板5’

GCTAGCCGG

PCR产物

互补序列-5’

3’-引物2第24页，共62页，2023年，2月20日，星期四带酶切位点的PCR产物GCAGAATTC

PCR产物5’--3’

GCTAGCCGG

PCR产物-5’

3’-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位点BamHI位点AATTC

PCR产物5’--3’

GCTAG

PCR产物-5’

3’-GCEcoRIBamHI两头各有一个粘性末端！第25页，共62页，2023年，2月20日，星期四2.与T载体直接连接（1）PCR产物两个3’端一般都有一个ATaqDNA聚合酶的特性：在DNA双链的3’端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）。（2）T载体的两个3’端人为地各加一个T利用TaqDNA聚合酶，当原料中只有dTTP时，被迫在平端载体上添加T！第26页，共62页，2023年，2月20日，星期四AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶载体PCR产物TATA第27页，共62页，2023年，2月20日，星期四四、DNA体外连接应注意的事项插入片断与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地连接。尽量避免平端连接。决不能进行非粘性末端连接。第28页，共62页，2023年，2月20日，星期四EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都产生GATC4个碱基的粘性末端。第29页，共62页，2023年，2月20日，星期四2.DNA插入的方向正确（1）用双酶切由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI第30页，共62页，2023年，2月20日，星期四3.插入基因的开放阅读框（ORF）正确（1）DNA定向插入（2）起始密码尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。ATGGAATTC载体ATGCGGAATTCT插入片断EcoRIEcoRIATGGAATTCT重组但移码突变！第31页，共62页，2023年，2月20日，星期四4.防止载体自身环化连接（1）提高插入片断的用量连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。（2）用碱性磷酸酶处理载体载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。5’

3’

载体插入片断第32页，共62页，2023年，2月20日，星期四1.载体自身环化连接（能存活）2.载体之间互相连接（能存活）3.插入片段互相连接（不能存活）4.一个载体与几个插入片段重组（能存活）五、载体和外源DNA插入片段的连接结果5.几个载体与一个插入片段重组（能存活）第33页，共62页，2023年，2月20日，星期四17第34页，共62页，2023年，2月20日，星期四1.目的增加受体菌细胞膜的通透性。第二节

重组体导入细菌细胞一、感受态大肠杆菌的制备第35页，共62页，2023年，2月20日，星期四使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。2.菌种第36页，共62页，2023年，2月20日，星期四第37页，共62页，2023年，2月20日，星期四用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。3.制备原理第38页，共62页，2023年，2月20日，星期四4.制备过程培养大肠杆菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃离心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重悬4℃离心收集菌4℃离心收集菌分装、-70℃冻存用冰冷的60mMCaCl2重悬Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重悬第39页，共62页，2023年，2月20日，星期四二、重组DNA导入大肠杆菌（1）转化（transformation)大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。（2）转染（transfection)大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。1.外源DNA导入细菌的几种方法（3）转导（transduction)借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。第40页，共62页，2023年，2月20日，星期四每gDNA转化成功的细菌克隆数。3.转化方法

2.转化率简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。（1）热休克法（heatshock）转化效率高（高于109/gDNA）。（2）电转化法第41页，共62页，2023年，2月20日，星期四10ng载体DNA100L感受态菌Onice混合，静置10分钟42ºC1分钟加入1mLLB培养基37℃摇1小时10-100L转化液涂含抗菌素的平板吸附DNA摄入DNA（1）热休克法第42页，共62页，2023年，2月20日，星期四LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分钟，2°C离心集菌冰冷的水重悬菌体2°C离心集菌冰冷的水重悬菌体2°C离心收集菌体少量冰冷的水重悬分装成50-300L

电转仪调为2.5kV,25F

脉冲控制器200-400

0.5g质粒DNA

Onice混合加入1mLSOC培养液37°C中速震荡60分钟10-100L转化液涂含抗菌素的平板转化（2）电转化法第43页，共62页，2023年，2月20日，星期四4.平板培养基培养细菌10-100L转化液涂于含抗菌素的平板37℃过夜第44页，共62页，2023年，2月20日，星期四环形重组质粒质粒自我连接线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。①环形质粒数（1）重组质粒

5.影响转化率的因素第45页，共62页，2023年，2月20日，星期四①生长状态制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。②必须在冰冷的条件下制备。要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。④储存感受态菌要在-70℃以下③CaCl2处理⑤使用感受态菌时必须迅速融化融化后一般不能再次冻存使用。（2）感受态细胞

（competentcells)第46页，共62页，2023年，2月20日，星期四把重组的噬菌体DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。6.体外包装的噬菌体的转导（1）体外包装（invitropackaging）

（2）转导（transduction）通过受体菌细胞表面的DNA接受器位点（receptorsite)，使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。第47页，共62页，2023年，2月20日，星期四cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32℃下培养细菌时能够保持溶源性。但当温度升高到44℃—45℃时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，DNA复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。（3）cI857基因突变的噬菌体

但由于该噬菌体的S基因上有一个突变，所以细菌还不裂解。第48页，共62页，2023年，2月20日，星期四cI857其它基因溶源状态（DNA不转录、不翻译）DNA阻遏蛋白阻遏蛋白44℃—45℃DNA转录、翻译合成外壳蛋白32℃第49页，共62页，2023年，2月20日，星期四噬菌体1外壳蛋白基因E发生了无义突变，不能合成头部蛋白，但能合成其它外壳蛋白（尾部蛋白）。在cI857基因突变的噬菌体的基础上，选择两种外壳蛋白的突变型噬菌体。（4）

互补型噬菌体

外壳蛋白基因D发生了无义突变，不能合成头部的包装识别蛋白，但能合成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。噬菌体2第50页，共62页，2023年，2月20日，星期四(5)体外包装过程

第51页，共62页，2023年，2月20日，星期四体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每gDNA能形成106噬菌斑）。（6）

转导

第52页，共62页，2023年，2月20日，星期四转化率高的菌株；有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；不育的菌株（不会与其他酵母接合）。第三节

外源基因导入真核细胞一、导入酵母细胞1.菌株选择如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his31第53页，共62页，2023年，2月20日，星期四（1）利用原生质球进行转化2.酵母的转化方法

酵母原生质体感受态酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因的酵母载体PEG（聚乙二醇）使细胞壁具有通透性，允许DNA进入。CaCl2使细胞膜具有通透性，允许DNA进入。

转化第54页，共62页，2023年，2月20日，星期四

酵母0.1mol/LLiCl处理插入外源基因的酵母载体感受态