基因工程的常规技术

基因工程的常规技术1第1页，共141页，2023年，2月20日，星期四第一节凝胶电泳技术

什么是电泳技术？电泳法，是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。2第2页，共141页，2023年，2月20日，星期四特点：1.可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的孔中泳动。2.电泳操作方法简便，电泳速度快3.分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰。

琼脂糖半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷本节主要介绍琼脂糖凝胶电泳技术。琼脂糖与琼脂有区别么？3第3页，共141页，2023年，2月20日，星期四

琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。D-半乳糖3，6-脱水-L-半乳糖4第4页，共141页，2023年，2月20日，星期四5第5页，共141页，2023年，2月20日，星期四琼脂糖凝胶电泳特点6第6页，共141页，2023年，2月20日，星期四琼脂糖凝胶的配置1.

根据电泳需要，配置合适浓度的电泳及制胶缓冲液。一般为1×TAE或0.5×TBE。

注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相同的。2.

根据制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的电泳缓冲液的三角锥瓶中，加入准确称量的琼脂糖粉。注意：总液体量不宜超过三角锥瓶的50%容量。3.在微波炉中加热溶解琼脂糖

注意：必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电泳图像模糊不清。加热时如胶液剧烈沸腾发泡，停止加热。微波炉中加热时间不宜过长。7第7页，共141页，2023年，2月20日，星期四琼脂糖凝胶的配置3.

使溶液冷却至60℃左右，如需要可在此时加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5ug/ml，并充分混匀——不提倡使用。

注意：溴化乙锭是一种致癌物质。使用含有溴化乙锭的溶液时，请戴用手套。溴化乙锭在可见光下会分解。5.将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子。凝胶厚度一般在3－5mm之间。

注意：不要产生气泡，溶液温度太高(>60℃)，会使得水分过分蒸发，改变凝胶离子浓度，影响电泳效果。6.在室温下使胶凝固（大约30分钟），然后放置于电泳槽中进行电泳。

注意：凝胶不立即使用时，用保鲜膜将凝胶包好在4℃下保存，或者放在制胶的缓冲液中，一般可保存2～5天。8第8页，共141页，2023年，2月20日，星期四琼脂糖凝胶缓冲液有几种缓冲液适用于天然双链DNA的电泳Tris-乙酸盐和EDTA缓冲液（pH8.0,TAE，也称为E缓冲液）Tris-硼酸盐缓冲液(TBE)Tris-磷酸盐缓冲液(TPE)9第9页，共141页，2023年，2月20日，星期四琼脂糖凝胶缓冲液10第10页，共141页，2023年，2月20日，星期四琼脂糖凝胶缓冲液TBE可以使用10次左右，而TAE用2~3次就要更换。电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA条带模糊或不规则DNA带迁移。电泳缓冲液刚好没过凝胶1mm为好，太多则电流加大，凝胶发热。11第11页，共141页，2023年，2月20日，星期四琼脂糖凝胶载样缓冲液载样缓冲液是上样时与样品一起加入泳道的。载样缓冲液有三个作用：增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内；使样品带有颜色便于上样操作；其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。上样缓冲液有几种，但基本都包括溴酚蓝和二甲苯氰FF。12第12页，共141页，2023年，2月20日，星期四琼脂糖凝胶载样缓冲液溴酚蓝在琼脂糖凝胶中迁移速率是二甲苯氰FF的2.2倍，这一特性与琼脂糖凝胶的浓度无关；在0.5×TBE琼脂糖凝胶电泳中溴酚蓝的速率约与长约300bp的线性双链DNA相同，而二甲苯氰FF约与长4kb的DNA相同。在0.5%-1.4%浓度的琼脂糖凝胶中基本不会变化。13第13页，共141页，2023年，2月20日，星期四琼脂糖凝胶载样缓冲液14第14页，共141页，2023年，2月20日，星期四影响电泳迁移率的因素DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在715第15页，共141页，2023年，2月20日，星期四影响电泳迁移率的因素DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7DNA分子大小迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子越大，摩擦阻力越大，同时大分子通过凝胶孔径的效率也低于较小的分子，所以分子大的迁移慢。等量的空间结构，紧密的电泳快（超螺旋>线性DNA）一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。16第16页，共141页，2023年，2月20日，星期四影响电泳迁移率的因素DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7简言之，浓度越大，分子孔径就越小，DNA迁移速率就越低，反之迁移速率就大。另外，浓度也跟凝胶的分辨率有关，浓度越大，分辨率越高，但分离的ＤＮＡ片段就越小。17第17页，共141页，2023年，2月20日，星期四琼脂糖凝胶的浓度18第18页，共141页，2023年，2月20日，星期四影响电泳迁移率的因素DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环。19第19页，共141页，2023年，2月20日，星期四影响电泳迁移率的因素DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7

低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5-8V/cm20第20页，共141页，2023年，2月20日，星期四影响电泳迁移率的因素DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7

包括标准琼脂糖和低熔点琼脂糖以及正在研制的介于二者之间的琼脂糖。其分辨率等各有不同。21第21页，共141页，2023年，2月20日，星期四琼脂糖凝胶的浓度22第22页，共141页，2023年，2月20日，星期四影响电泳迁移率的因素DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7溶液pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大，尤其对于蛋白质等两性分子，缓冲液pH还会影响到其电泳方向;溶液的离子强度过低，会使电导率降低，DNA不是全然不动就是迁移极慢；而离子过强时，电导率上升，会产生大量热能，使凝胶变化甚至熔化，也会使DNA变性。23第23页，共141页，2023年，2月20日，星期四影响电泳迁移率的因素DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7染色剂溴化乙锭插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加，因此，线性DNA-染料复合物在凝胶中的迁移率约降低15%。24第24页，共141页，2023年，2月20日，星期四DNA分子的迁移速度与其分子质量的对数值成反比关系。

在电场的作用下，带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链，依靠无反应活性的稳定的介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。

琼脂糖凝胶电泳基本原理25第25页，共141页，2023年，2月20日，星期四

当用EB对DNA样品染色时，加入的EB就插入DNA分子中形成荧光结合物，荧光的强度与DNA含量成正比，如果用DNA片段的标准品作电泳对照，就可以估计出待测样品的分子量大小和浓度。26第26页，共141页，2023年，2月20日，星期四DNA的琼脂糖凝胶电泳检测

+-仪器

电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、移液枪；药品Agarose、TAEbuffer、EB（溴化乙锭）上样缓冲液（6X）0.25%溴酚蓝（指示100-200bp的带）、0.25%二甲苯青（指示800-100bp的带）、40%蔗糖；水溶液4℃保存。27第27页，共141页，2023年，2月20日，星期四玻璃片28第28页，共141页，2023年，2月20日，星期四29第29页，共141页，2023年，2月20日，星期四预染色的标本30第30页，共141页，2023年，2月20日，星期四31第31页，共141页，2023年，2月20日，星期四32第32页，共141页，2023年，2月20日，星期四33第33页，共141页，2023年，2月20日，星期四第二节分子杂交技术

所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。

核酸杂交技术主要有Southern杂交、Northern杂交和菌落原位杂交等。34第34页，共141页，2023年，2月20日，星期四一、探针与探针标记杂交的主要目的是为了检测出同源DNA序列，而为了达到这一目的，必需要有标记的探针。带有能检测的标记物的DNA或RNA叫探针。使DNA或RNA带有可检测的标记物的过程叫探针标记。35第35页，共141页，2023年，2月20日，星期四1.切口平移标记用一定浓度的DNaseI在双链DNA的一条链的有限位置上打开切口。利用DNA聚合酶I的5’→3’的核酸外切酶活性将DNA一条链上的核苷酸一个一个的切除，同时暴露出另一条单链DNA。以这条单链DNA为模板，利用DNA聚合酶I的5’→3’的DNA聚合功能把一个一个带有标记的dNTP合成上去。36第36页，共141页，2023年，2月20日，星期四37

大肠杆菌聚合酶I的应用示例缺口转移制备探针PolI+Mg2++［α－32P］

dNTPs37第37页，共141页，2023年，2月20日，星期四2.随机引物标记能与任何DNA模板的多个位点配对互补的多个不均一序列寡聚核苷酸DNA片段叫随机引物。DNA聚合酶Klenow大片段能在随机引物的引导下以带有标记的dNTP为原料合成新的与模板DNA互补的探针。38第38页，共141页，2023年，2月20日，星期四二、Southern杂交

根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E.Southern于1975年首先设计出来的，故又叫SouthernDNA印迹转移技术。39第39页，共141页，2023年，2月20日，星期四（a）（b）（c）（d）（e）基因组DNADNA限制片段硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的基因DNA片段X光底片杂交步骤：1.酶切2.电泳(变性）3.转膜(注意DNA要小于2kb）4.封闭（预杂交）5.杂交6.显影40第40页，共141页，2023年，2月20日，星期四核酸杂交常用几种膜的性能比较41第41页，共141页，2023年，2月20日，星期四

SouthernDNA印迹杂交之X光显像图片

水稻（OryzasativaL.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加样在含有EB染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带，表明含有水稻的psbA基因序列。42第42页，共141页，2023年，2月20日，星期四三、Northern杂交1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与Southern印迹杂交技术十分类似，所以叫做Northern印迹技术（Northernblotting）。43第43页，共141页，2023年，2月20日，星期四Southern杂交和Northern杂交的主要差别：1.对象不同（DNA/RNA）2.DNA在凝胶电泳分离后，用碱处理变性，形成单链。

RNA一般是进行变性电泳，在分离RNA的同时消除二级结构。

RNA变性电泳方法主要有甲醛变性电泳、羧甲基变性电泳和乙二醛变性电泳三种。44第44页，共141页，2023年，2月20日，星期四四、Western杂交Westernblotting是用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，然后将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素膜或其它支持物上，然后同放射性同位素标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技术广泛用于基因在蛋白质水平上的表达研究。45第45页，共141页，2023年，2月20日，星期四原理

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂N，N，N，N—四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。46第46页，共141页，2023年，2月20日，星期四原理而SDS仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。47第47页，共141页，2023年，2月20日，星期四十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate，简称SDS）是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间以及与其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变原有的空间构象。特别是在强还原剂，如巯基乙醇存在下，由于蛋白质分子内的二硫键被还原剂打开，不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与SDS充分结合.蛋白质-SDS复合物在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒。不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为1.8nm，而长轴则随蛋白质的分子量成正比变化。这样的蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度，也就是蛋白质分子量的函数。带负电荷的蛋白质-SDS复合物由于结合了大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异。原理48第48页，共141页，2023年，2月20日，星期四实验原理PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。49第49页，共141页，2023年，2月20日，星期四各部分凝胶配制50第50页，共141页，2023年，2月20日，星期四

实验过程

1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干,准备2个干净的锥形瓶.

2.把玻璃板在灌胶支架上固定好.

※固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板.

3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入,大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水,静置40分钟.

※凝胶配制过程要迅速,催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡.

51第51页，共141页，2023年，2月20日，星期四

实验过程.

※水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡

※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面.

4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置40分钟.

※样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平.

52第52页，共141页，2023年，2月20日，星期四实验过程5.拔出样梳后,在上槽内加入缓冲液,没过锯齿时可拆去

底端的琼脂糖.

※要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果.

6、加样三个。（1）取10µl标准蛋白溶解液于EP管内，再加入10µl2倍样品缓冲液，上样量为20µl。

（2）取10µl样品1溶液，再加入10µl2倍样品缓冲液，上样量分别为5µl和10µl。

7.用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前,样品在

沸水中加热3分钟，去掉亚稳态聚合。

※注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下

沉时会发生扩散.

※为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样.

53第53页，共141页，2023年，2月20日，星期四实验过程8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。

9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。

10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。

※剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分.

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11.实验结果分析。54第54页，共141页，2023年，2月20日，星期四55第55页，共141页，2023年，2月20日，星期四五、菌落原位杂交

也叫原位杂交，是指把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上，使溶菌的DNA同滤膜原位结合，带有DNA的滤膜烘干后，与放射性同位素标记特异的DNA或RNA探针杂交。是直接菌落或噬菌斑为对象来检测重组子的技术。56第56页，共141页，2023年，2月20日，星期四检测重组体克隆的菌落杂交技术57第57页，共141页，2023年，2月20日，星期四第三节、PCR技术58第58页，共141页，2023年，2月20日，星期四PCR技术的创建KaryB.Mullis（穆利斯（美））Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。

1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。

1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术

1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。59第59页，共141页，2023年，2月20日，星期四一、PCR技术的基本成分

PCR的成分包括：待扩增的模板、引物、DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸的混合物以及反应缓冲液。模板是含有待扩增序列的DNA或从mRNA反转录来的cDNA。60第60页，共141页，2023年，2月20日，星期四Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)405060708090100100806040201988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术61第61页，共141页，2023年，2月20日，星期四TaqDNA聚合酶CharacteristicsofTaqPolymerase

62第62页，共141页，2023年，2月20日，星期四PCR的引物

是指与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片断。63第63页，共141页，2023年，2月20日，星期四引物的设计原则：1.引物碱基G＋C含量以45%－55%为宜。

2.其长度通常在15~30个核苷酸之间。

3.Tm值应高于55℃。

引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。2个引物要有近似的Tm值，以免相差太大，引起非特异性扩增；一般退火温度为最高Tm值的引物温度减5℃.64第64页，共141页，2023年，2月20日，星期四4.PCR扩增的长度一般：<2kb。5.引物3’端碱基要求严格配对。Taq酶在3′末端错配时延伸效率是不一样的，延伸效率为T>G＝C>A。即当引物3′末端为A时，即使有错配碱基也最不易延伸，所以引物设计时可将3′末端设计为A，以提高复制精确性。另一种理论是3′末端应设计为G或C，因为G和C的氢键多于A与T，能更好地与模板结合开始DNA合成，当然对错配延伸效率方面就不能苛求了。总而言之，引物的3′末端不要考虑使用T。

6.尽量减少自身配对。

7.避免两条引物互补。

8.引物要特异。

9.可以在引物的5’端加上合适的酶切位点。一般引物自身配对形成茎环结构，茎的碱基对数不大于3，两条引物间配对碱基数小于5个。65第65页，共141页，2023年，2月20日，星期四引物的设计可以参照：两分钟StepByStep学会引物设计软件

Primerpremier5.0/oligo软件

核酸基因技术讨论版/生物信息学讨论版/PCR技术讨论版/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi

引物设计网址：66第66页，共141页，2023年，2月20日，星期四反应条件1．PCR缓冲液常用的1×PCR缓冲液为10mmol／LTris-HClpH8.3(常温)，50mmol／LKCl，1.5mmol／LMgCl2。由试剂公司与Taq酶一起提供。

(1)Mg2+离子浓度：Mg2+离子浓度对PCR反应影响很大，因为[Mg2+]与引物-模板及产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的生成、产物的忠实性、酶活力、产物的产量等诸多因素有关。Mg2+一般使用浓度为0.5～2.5mmol／L，必要时可以0.5mmol／L梯度间隔做Mg2+最适浓度试验。67第67页，共141页，2023年，2月20日，星期四(2)dNTP：常用dNTP浓度为20μmol／L(可用范围为20～200μmol／L)。dNTP的用量与PCR产量及产物忠实性有关，dNTP量过少时合成的产物减少。(3)K+离子浓度：PCR反应中K+离子的作用是促进Taq酶活力与促进引物退火，一般使用浓度是50mmol／L，但当K+离子浓度高于50mmol／L时会抑制Taq酶活力。68第68页，共141页，2023年，2月20日，星期四2．模板PCR模板可以是DNA或RNA，RNA需反转录后再扩增。模板可以是基因组DNA或纯化的质粒DNA，当然两者的DNA量在PCR起始模板中相差很大。每个PCR反应中加入的模板数量可在102～105分子之间，必要时可低至50个分子，模板的量少时应酌情增加循环次数。小于100ng的哺乳动物细胞基因组DNA(相当于约104个细胞)，经30个循环，10％的反应物应能够在溴化乙锭染色的凝胶上看到一条主要产物带。使用较大量的模板时，循环数可减少；如果模板量很少，可能需要增加至45个循环反应。69第69页，共141页，2023年，2月20日，星期四3．引物浓度常用引物浓度为0.1～0.5μmol／L。随着引物浓度的降低，PCR反应的特异性提高但产物得率降低；随着引物浓度的升高，情况正好相反。70第70页，共141页，2023年，2月20日，星期四二、PCR技术的原理和过程

947260？主要是为了保险起见，使模板DNA的二级结构充分打开。

有些化学修饰的热启动酶这一步时间还要长，目的是充分释放酶活71第71页，共141页，2023年，2月20日，星期四温度（℃）时间（min）94726094℃变性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循环1循环2循环3PCR反应的温度循环周期

PCR反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。72第72页，共141页，2023年，2月20日，星期四73第73页，共141页，2023年，2月20日，星期四PCR扩增过程中片段增殖的计算74第74页，共141页，2023年，2月20日，星期四PCR反应体系的确立WaterBuffer（10×）Mg++（25mM）dNTPs（10mM）Primer1（10uM）Primer2（10uM）Taq（5U/uL）Templets12.821.60.4110.2120uL反应体系中各成分的母液浓度及加入量PCR扩增程序举例Tem.94℃94℃60℃72℃72℃Time00:08:0000:00:3000:00:4000:01:0000:07:00Cycles――30――75第75页，共141页，2023年，2月20日，星期四经典循环参数（500bp以内）94℃30s55℃45s72℃1min94℃5min×30次72℃5min42℃forever76第76页，共141页，2023年，2月20日，星期四PCR扩增结果分析举例M1234567MM,marker;1-2,PCRforCP4-EPSPSgene;3-4,PCRfor35SPromoter;5-6,PCRforlectingene;7,Negtivecontrol.77第77页，共141页，2023年，2月20日，星期四PCR常见问题

无扩增产物

非特异性扩增

拖尾

假阳性78第78页，共141页，2023年，2月20日，星期四PCR常见问题之一无扩增产物模板:含有抑制物，含量低Buffer对样品不合适引物设计不当或者发生降解反应条件：退火温度太高，延伸时间太短

原因对策纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量更换Buffer或调整浓度重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物降低退火温度、延长延伸时间现象：正对照有条带，而样品则无；79第79页，共141页，2023年，2月20日，星期四PCR常见问题之二

非特异性扩增

现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。80第80页，共141页，2023年，2月20日，星期四PCR常见问题之二引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多Mg2+浓度偏高退火温度偏低循环次数过多

原因对策重新设计引物或者使用巢式PCR适当降低模板或引物浓度适当减少酶量降低镁离子浓度适当提高退火温度或使用二阶段温度法减少循环次数

非特异性扩增81第81页，共141页，2023年，2月20日，星期四PCR常见问题之三

拖尾

现象：产物在凝胶上呈Smear状态。M1282第82页，共141页，2023年，2月20日，星期四PCR常见问题之三模板不纯Buffer不合适退火温度偏低酶量过多dNTP、Mg2+浓度偏高循环次数过多

原因对策纯化模板更换Buffer适当提高退火温度适量用酶适当降低dNTP和镁离子的浓度减少循环次数

拖尾83第83页，共141页，2023年，2月20日，星期四PCR常见问题之四

假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况)

原因：靶序列或扩增产物的交叉污染

现象：空白对照出现目的扩增产物

对策：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。84第84页，共141页，2023年，2月20日，星期四三、荧光定量PCR是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程结合相应软件可以对产物进行分析，计算待测样品的初始模板量。荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪，通常配有电脑系统及相应的软件。标记方法主要有：内插染料、双标记探针、分子信标等。85第85页，共141页，2023年，2月20日，星期四SYBRGREENI1、SYBRGreen法86第86页，共141页，2023年，2月20日，星期四87第87页，共141页，2023年，2月20日，星期四SYBRGreen熔解曲线分析

88第88页，共141页，2023年，2月20日，星期四2、TaqMan探针法

89第89页，共141页，2023年，2月20日，星期四TaqMan作用机理

90第90页，共141页，2023年，2月20日，星期四Molecularbeacon？91第91页，共141页，2023年，2月20日，星期四荧光定量PCR的优点1.全封闭的PCR过程，无需跑胶。2.采用dUTP－UNG酶防污染，有效降低污染机会。原理：UNG酶的作用原理是选择性水解断裂含有dU的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的DNA链，在碱性介质以及高温下会进一步水解断裂，从而被消除.UNG酶的最佳活性温度为50℃，95℃灭活。作用：为保证PCR结果的准确性，要预防非特异性PCR扩增和污染。常用的措施是使用UNG酶(Uracil-N-Glycosylase)和Taq酶热启动。PCR反应最常见,最重要的污染物是PCR产物,防污染热启动PCR试剂盒以dUTP取代dTTP，所以PCR产物都是含有dU的DNA链。在PCR开始前增加50℃的保温步骤，UNG酶即可将反应体系中已有的U-DNA污染物中的尿嘧啶碱基降解，并在随后变性这步的条件下DNA链断裂,消除由于污染DNA产生的扩增，从而保证扩增结果的特异性，准确性。同时UNG酶被灭活,不会再降解新扩增的产物U-DNA。92第92页，共141页，2023年，2月20日，星期四3.对样品扩增的整个过程进行实时监控。4.使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性。5.在样品扩增反应的最佳阶段进行数据采集，增加了定量的精确性。6.线性关系直接。7.结果分析更加快捷方便。荧光定量PCR的优点93第93页，共141页，2023年，2月20日，星期四第四节、生物芯片

美国《财富》杂志载文指出，在20世纪科技史上有两件事影响深远，一是微电子芯片，它是计算机和许多家电的心脏，它改变了我们的经济和文化生活，并已进入每一个家庭；另一件事就是生物芯片，它将改变生命科学的研究方式，革新医学诊断和治疗，极大地提高人口素质和健康水平。94第94页，共141页，2023年，2月20日，星期四第四节、生物芯片生物芯片就是在一块指甲大小的玻片、硅片、尼龙膜等材料上放上生物样品，然后由一种仪器收集信号，用计算机分析数据结果。目前制备芯片的固相材料有玻片、硅片、金属片、尼龙膜等。生物芯片主要分为基因芯片和蛋白芯片。95第95页，共141页，2023年，2月20日，星期四一、基因芯片基因芯片技术是指将大量寡核苷酸或DNA探针（与核酸分子杂交相反，亦称靶基因）按特定的排列方式固化在固相支持物表面，按碱基互补配对的原则，与标记的特异的单链DNA或RNA（待测样品）分子杂交形成双链，通过对杂交信号的检测分析，即可得出样品分子的数量和序列信息。由于基因芯片上固定的探针可以是cDNA、寡核苷酸或来自基因组的基因片段，且这些探针固化于芯片上形成基因探针阵列，故基因芯片又被称为DNA芯片、DNA阵列、cDNA芯片、寡核苷酸阵列等。96第96页，共141页，2023年，2月20日，星期四DNA芯片技术工作流程主要包括：芯片的制备、样品的准备与标记、杂交、信号检测和数据分析处理，其中最关键的是芯片的制备。DNA芯片基本应用可分为两个主要方面：定量分析（主要指测序和突变检测）与定性分析（主要指对基因表达的研究）。如：1.DNA序列测定

2.突变及多肽性分析

3.基因表达分析

4.基因组研究

5.基因诊断

6.药物研究与开发97第97页，共141页，2023年，2月20日，星期四基因芯片杂交检测流程图98第98页，共141页，2023年，2月20日，星期四二、蛋白芯片

蛋白芯片是以蛋白质代替DNA作为检测对象。其原理是将各种蛋白质有序的固定于某种介质的载体上成为检测的芯片，然后用标记了有特定荧光物质的抗体与芯片作用，与芯片上的蛋白质相匹配的抗体将与其对应的蛋白质结合，在将未与芯片上的蛋白质互补的抗体洗去之后利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，检测芯片上各点的荧光强度，在通过计算机分析蛋白质之间的相互关系以及基因表达功能等。99第99页，共141页，2023年，2月20日，星期四基因文库的基本概念

从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为：基因组文库（含有全部基因）

cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）

第五节、基因文库构建100第100页，共141页，2023年，2月20日，星期四一、基因组文库基本步骤:1.分离基因组DNA2.DNA的断裂物理剪切(包括吹吸、振荡和超声波）和限制性酶解

3.DNA片断的分离与连接

4.包装，转染或者转化101第101页，共141页，2023年，2月20日，星期四二、cDNA文库的构建基本步骤：

1)mRNA分离、纯化和分级分离

2)cDNA的合成

3)与载体的连接

4)转化102第102页，共141页，2023年，2月20日，星期四RNA提取流程－－样品前处理注意点

选择新鲜血液，不得超过4小时选择新鲜的幼嫩组织选择处于生长旺盛的时期收集细胞选择新鲜组织，生长旺盛的组织103第103页，共141页，2023年，2月20日，星期四可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到的白细胞然后加入一定量的TRNzol，-70℃保存较长时间去掉培养基，加入一定量TRNzol-70℃保存较长时间推荐使用专门的RNA样品储存液进行储存液氮或加入RNase抑制剂中保存，避免反复冻融RNA提取流程－－样品前处理中如何保存样本104第104页，共141页，2023年，2月20日，星期四所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即①样品细胞或组织的有效破碎；②有效地使核蛋白复合体变性；③对内源RNA酶的有效抑制；④有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；⑤对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶活性105第105页，共141页，2023年，2月20日，星期四模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率。在提取过程中要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。106第106页，共141页，2023年，2月20日，星期四所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理。DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC水溶液会致癌,因而使用时需小心。107第107页，共141页，2023年，2月20日，星期四RNA提取的通用方法

RNA提取的一般步骤RNA提取的一般步骤是：破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA.108第108页，共141页，2023年，2月20日，星期四破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、SDS、蛋白酶K等破碎组织加入β-ME可以抑制RNA酶活性。

分离RNA一半用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。

沉淀RNA一般用乙醇、3MNaAc（pH-5.2）或异丙醇。

洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。

RNA提取的通用方法109第109页，共141页，2023年，2月20日，星期四二、cDNA克隆片段的获得cDNA第一链的合成

第二链的合成双链DNA末端的处理110第110页，共141页，2023年，2月20日，星期四mRNA1.cDNA第一链的合成

5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’cDNA第一链引物退火逆转录酶dNTPs111第111页，共141页，2023年，2月20日，星期四2.cDNA第二链的合成

煮沸NaOH自身引导法：获得的双链cDNA5’端会有几对碱基缺失AAAAAAAAAAAAAA5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’TTTTTTTTTTTTTTp

5’TTTTTTTTTTTTTTp

5’AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTOH

3’KlenowdNTPsS1112第112页，共141页，2023年，2月20日，星期四3)第二链cDNA的合成氢氧化钠消化杂合双链中的mRNA链

第一链cDNA的3'-末端就会形成一个发夹环

合成第二链cDNA

S1核酸酶消化连接处

自身引导法合成cDNA第二链113第113页，共141页，2023年，2月20日，星期四DNApoldNTPsRNaesH置换合成法：获得的双链cDNA5’端也会有几对碱基缺失5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’AAAAAAAAAAAAAAp

5’5’S1

AAAATTTOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’5’TTTTTTTTTTTTTTOH

3’AAAAAAAAAAAAAA

5’5’TTTTTTTTTTTTTT

3’3’T4-DNAligase114第114页，共141页，2023年，2月20日，星期四115第115页，共141页，2023年，2月20日，星期四常用方法116第116页，共141页，2023年，2月20日，星期四CH3CH3CH3CH3CH3CH3接头加接头117第117页，共141页，2023年，2月20日，星期四3.双链DNA末端的处理双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：

平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收

平头两端分别接同聚物尾和酶切位点，便于片段回收加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收

118第118页，共141页，2023年，2月20日，星期四基因组DNA文库与cDNA文库的比较119第119页，共141页，2023年，2月20日，星期四感受态细胞的制备及质粒DNA的转化Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态

基本方法：细菌经0℃的低渗CaCl2处理，使细菌处于感受态，然后加入甘油-70℃条件下保存120第120页，共141页，2023年，2月20日，星期四感受态制备成功的验证

分别取2个200µl感受态细胞悬液

第一组——转化实验组：

0.5µl(50ng)pUC18/pUC19+200µl感受态细胞

第二组——受体菌对照组：

0.5µl无菌水+200µl感受态细胞悬液121第121页，共141页，2023年，2月20日，星期四实验结果含抗生素LB平板培养基

第一组有菌落，第二组无菌落

第一组、第二组均无或有菌落

普通LB平板培养基第一组、第二组均无菌落

第一组、第二组均有菌落

成功失败失败成功122第122页，共141页，2023年，2月20日，星期四123第123页，共141页，2023年，2月20日，星期四转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。124第124页，共141页，2023年，2月20日，星期四①感受态细胞新鲜配制的或从-80℃冻存取出后置于冰水中融化。②取出分装到Eppendorf管中，每管100~200uL。③加入需转化的DNA溶液25ul充分混匀(1~5ug/mLDNA)。④冰水中放置30分钟。⑤37℃或42℃水浴2分钟。(热休克)⑥冰浴2min。⑦每管再加入1mLLB培养基，37℃振荡培养1小时。⑧取出后稍加离心，去掉部分上清，留500uL或250mL

LB则全部铺板。（2）转化步骤125第125页，共141页，2023年，2月20日，星期四第六节、酵母双杂交系统酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。126第126页，共141页，2023年，2月20日，星期四

酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有DNA结合功能域(DNAbindingdomain,DNA-BD)和转录激活结构域（activationdomain，DNA-AD）。这两个结构域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstreamactivatingsequence,UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。127第127页，共141页，2023