微生物遗传结合转移

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细菌质粒的接合转移

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三亲本杂交微生物遗传学实验第2页/共9页实验原理：1、质粒的转移性细菌的遗传重组有接合转移、转化和转导三种主要方式。接合转移是指供体和受体细胞间直接接触，质粒DNA从供体向受体转移的过程。质粒可分为可转移质粒和非转移质粒两类，转移质粒带有完整的编码转移酶的tra基因,质粒能自主地从一个细胞转移到另一个细胞,甚至还能带动供体细胞的染色体DNA向受体细胞转移，这类质粒常被称为自主转移质粒。如大肠杆菌的F质粒。有些质粒不含tra基因,但含有质粒转移起始位点oriT，虽不能自主转移，但能被其他一些含完整tra基因的质粒所诱动,这类质粒又被叫做可诱动质粒。第3页/共9页

第4页/共9页实验原理：2、本实验所用供体质粒本实验中要转移的质粒是pHN102，它是在广宿主范围的稳定载体pTR102

中插入生物发光酶基因luxAB

构建而成。pTR102中带有含par基因的稳定性片段（stabillty）,它能在较多革兰氏阴性细菌中稳定存在，它含有质粒转移起始位点oriT，不含完整的转移基因tra，必须在含有

tra基因的辅助菌株诱动下，pTR102

才能从供体菌向受体菌转移。为有效筛选转移接合子

(transconjugant),pHN102

质粒上带有Tc抗性和生物发光酶基因(luxAB）两个标记。加入luxAB的底物癸醛（Decanal）后，菌体可发出微弱荧光。第5页/共9页实验原理：3、三亲本杂交本实验中的辅助菌株是E.coli(pPK2073），pPK2073中带完整的tra基因，将已活化的供体菌、协助菌与受体菌混合起来，使菌体细胞紧密接触，供体菌中的质粒（pHN102

）可以在协助菌的帮助下通过接合转移方式导入受体菌（费氏中华根瘤菌Sinorhizobiumfredii

）中。因此该接合转移过程称为三亲本杂交。实验菌株供体菌：E.coliDH5α(pTR102-luxAB)(TcR、luxAB)

受体菌:Sinorhizobiumfredii(TcS)辅助菌:E.coliMM294(pRK2073)（SpecR）

实验产物转移接合子:S.fredii(pTR102-luxAB),(TcR，luxAB)第6页/共9页实验准备菌株活化（教师做）：将受体、供体、辅助菌分别培养到对数期：

E.coli(pTR102-luxAB):液体LB+Tc20μg/ml,37OC震荡培养1夜；

S.fredii:TY液体,28OC震荡培养2天；

E.coli(pPK2073):液体LB+Spe50μg/ml,37OC震荡培养1夜倒平板（学生做）：第1、2组：倒不加Tc的SM（平皿上标记“纯SM”）：融化SM后，每瓶加混合维生素0.2ml（装在1.5ml离心管中，标记“维”)，混匀倒平板，3瓶250ml的培养基共倒36－40皿。凝固后，报纸包好，放冰箱冷藏室（4OC）备用。第3、4组：倒TY平板：融化1瓶TY固体,倒平板12-13个,凝固后分发到4个超净台使用。第5、6组：倒SM＋Tc平板（平皿上标记“SM＋Tc”）：融化SM后，每瓶加混合维生素0.2ml和四环素0.5ml（Tc,10mg/ml,装在1.5ml离心管中，标记“Tc”），混匀倒平板，3瓶250ml的培养基共倒36－40皿。凝固后，报纸包好，放冰箱冷藏室(4OC)备用。

第7页/共9页操作步骤：三菌混合培养（第1天）(1)吸取供体菌、辅助菌各0.4ml，吸受体菌0.6ml，都加入同一个1.5ml离心管内（每个同学做1管），8000转/min离心1分钟。

(2)倒上清，向沉淀加1ml的TY液体，用tip上下抽吸，洗涤菌体，再8000转/min离心1分钟，倒上清，留沉淀。

(3)用镊子取灭菌滤纸片贴于已准备好的TY平板上（每个同学1片，3片/平板，平皿背面标记姓名），用200μl的tip抽吸离心管内沉淀的菌体，打散成浓菌液，将之加到滤纸片中央（切勿倾