微生物细胞的破碎技术

微生物细胞的破碎技术第1页/共41页

1.1目的物位置胞外产品：各种胞外酶、胞外多糖、细胞代谢物细胞本身：单细胞蛋白（SCP）胞内产品:

胞内酶，基因工程产物等1.2细胞的破碎定义

用物理、化学、酶或机械的方法破坏细胞壁或细胞膜。1.3细胞壁特点a.保护细胞b.调节、控制代谢c.抗机械撞击第3章微生物细胞的破碎

1.微生物细胞的破碎技术概述第2页/共41页第3页/共41页第4页/共41页2细胞壁的组成和结构

1.细胞壁的组成和破碎阻力2.细胞壁的结构

第5页/共41页2.1细胞壁的组成和破碎阻力2.1.1细菌：肽聚糖，蛋白质，磷壁酸，糖，脂；主要阻力来自于肽聚糖的网状结构。2.1.2酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质，脂；主要阻力来自于壁结构交联的紧密程度和厚度。2.1.3丝状真菌：多糖，蛋白质，脂类，葡聚糖，几丁质，主要阻力来自于壁强度和聚合物网状结构。back第6页/共41页2.2细胞壁的结构细菌的细胞壁酵母菌的细胞壁丝状真菌的细胞壁backnext第7页/共41页第8页/共41页back第9页/共41页

2.2.1细菌细胞壁的组成

a：肽聚糖

b：氨基酸：D-丙氨酸，D-谷氨酸，L-丙氨酸，L-赖氨酸

c：磷壁质：糖醛磷酸酯的聚合物－革兰氏阳性菌

d：糖

e：脂质－革兰氏阴性菌

2.2.2革兰氏阳性菌

a.15－50层肽聚糖片层

b.壁磷壁酸和膜磷壁酸

2.2.3革兰氏阴性菌

a.1－2层肽聚糖片层

b.脂蛋白（将外膜固定于肽聚糖层）、脂质双层及脂多糖（稳定细胞结构）第10页/共41页back酵母菌的细胞壁第11页/共41页back丝状真菌的细胞壁第12页/共41页各种微生物细胞壁的结构与组成

第13页/共41页3微生物细胞的破碎技术

第14页/共41页3.1细胞破碎机理图第15页/共41页3.1.1高压匀浆法高压匀浆器原理利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环造成细胞破裂,从低压环境释放出来。构造：高压位移泵、针形阀影响因素：a.Tb.操作压力第16页/共41页高压匀浆器第17页/共41页第18页/共41页3.1.2珠磨法原理：在膜腔中装入小玻璃球或小钢球，在搅拌浆的作用下，它将使细胞悬浮液与细胞悬浮液，细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起发生碰撞、剪切，使细胞在某种程度上破碎，再由液珠分离器分开、排出。（这些装置的主要缺点是在破碎期间样品温度迅速升高，通过用二氧化碳来冷却容器可得到部分解决。）构件：微珠、冷却装置、搅拌浆、液珠分离器、物料进出口。见图第19页/共41页高速珠磨机第20页/共41页影响因素：⑴搅拌速度－适中⑵细胞浓度－最佳⑶珠粒的大小、用量⑷T－5-40℃⑸流量－小(6)微生物特性第21页/共41页3.1.3超声波法原理：细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。适用：对于不同菌种的发酵液、超声波处理的效果不同，杆菌比球菌易破碎、革兰氏阴性菌细胞比革兰氏阳性菌细胞容易破碎，对酵母菌的效果级差。特点：该法不适于大规模操作，因为放大后，要输入很高的能量来提供必要的冷却，这是困难的。第22页/共41页电声超声波发生器第23页/共41页影响因素：a.振幅－声能b.粘度－小c.表面张力－小d.用量e.球珠大小f.探头材料、形状－钛，小g.流速第24页/共41页

3.2.1化学法定义：化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞中某些组分的方法。常用：a.酸碱：可以使蛋白质水解或蛋白质电荷改变b.脂溶性有机溶剂如丁醇、丙酮、氯仿及尿素等－溶解细胞壁脂质层从而使细胞溶解或使某些组分从细胞内渗漏出来（但是，这些试剂容易引起生化物质破坏，还会带来分离和回收化学物质的问题。）c.表面活性剂－两性基团（亲水基团、疏水基团）第25页/共41页

3.2.2酶解法①定义：利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键使细胞壁通途性发生改变，从而达到破壁的目的。②优点：专一性强，条件温和，破坏少，收率高，无细胞碎片。③缺点：酶水解费用较贵，一般只适用于小规模的实验室研究。④常用酶：

a.溶菌酶，它能专一地分解细胞壁上糖蛋白分子的α-1，4糖苷键，使脂多糖解离，经溶菌酶处理后的细胞移至低渗溶液中使细胞破裂。第26页/共41页b.细菌：糖苷酶，多肽酶，N-乙酰胞壁酰胺-L-丙氨酸酰胺酶C.真菌、酵母：葡聚糖酶，甘露糖酶，甲克素酶，蛋白酶d.藻类：纤维素酶⑤注意事项a.适应酶以及酶反应体系b.特定的反应条件：T、pH、浓度等c.与其他方法结合起来Eg:辐射、高浓度盐、加EDTA及生长因子等第27页/共41页3.2.3渗透压冲击渗透：高→低原理：将细胞放在高渗透压的介质中(如一定浓度的甘油或蔗糖溶液，细胞失水)，待达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。适用：渗透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的菌，或者细胞壁预先用酶处理，或合成受抑制而强度减弱时才是合适的。

第28页/共41页3.2.4冻结-融化法定义：将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融化，反复多次而达到破壁作用。原理：疏水键破坏；水结成冰体积增大。适用：对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。但通常破碎率很低即使反复循环多次也不能提高收率。另外，还可能引起对冻融敏感的某些蛋白质的变性。第29页/共41页3.2.5干燥法可采用空气干燥，真空干燥，喷雾干燥和冷冻干燥等。空气干燥主要适用于酵母菌。真空干燥适用于细菌的干燥。冷冻干燥适用于较不稳定的生化物质。干燥法条件变化较剧烈，容易引起蛋白质或其它组织变性。第30页/共41页细胞破碎主要方法

第31页/共41页机械破碎法与非机械法比较

第32页/共41页3.3破碎方法的选择细胞的数量破碎条件——目标产物对破碎条件的敏感性破碎目标——待破碎细胞的机械强度第33页/共41页3.3.1破碎方法选择原则(1)目标生化物质的位置：(2)目标生化物质对破碎条件的敏感性：

(3)

破碎程度、目的

(4)

规模、经济第34页/共41页3.4破碎率的测定1.直接测定法－平板计数2.间接法－测定释放的蛋白质量或酶的活力或相对电导率第35页/共41页4.基因工程表达产物的后处理

——包含体的分离与复性

4.1什么是包含体外源蛋白质基因在受体菌中表达时形成的不溶的没有活性的蛋白质聚集体称为包含体。（包含体内除目标蛋白外还有微量的质粒，rRNA和RNA聚合酶。）

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4.2包含体形成的原因

蛋白质的多肽链折叠成立体结构的过程中受周围环境的影响，分子间的相互作用影响到分子内的折叠。a.由于表达的外源蛋白缺少某些折叠的协助因子或局部微环境不适宜，不能正确的形成次级键。b.表达率过高，合成速度太快，无足够的时间折叠，二硫键不能正确配对，过多的蛋白质间非特异性结合，导致溶解度降低。

c.重组蛋白氨基酸组成－硫氨基酸越多越易形成包含体。

第37页/共41页d.重组蛋白质是E.coli异源蛋白，大量生成后，缺乏修饰所需要的酶和辅助因子，致使中间体大量累积，异形成包含体。E.蛋白质的自身溶解性特点a.稳定性好b.表达量高c.杂蛋白少e.对机械搅拌和超声破碎不敏感，易破碎

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包含体分离的工艺路线

收集菌体细胞破碎离心分离洗涤除变性剂复性变性溶解第39页/共41页1.破碎2.洗涤－尿素