微生物的生长及其控制用

微生物的生长及其控制用第1页/共103页

微生物的生长及其控制第六章第2页/共103页教学时数：6学时教学目的与要求：要求学生了解食品中微生物控制的原理，理解常见化学杀菌剂和抑菌剂的作用机理与使用特点，掌握微生物的生长规律，影响食品中微生物生长的主要因素；食品中微生物控制的基本策略，灭菌、消毒、防腐等的异同。本章重点和难点：微生物的生长规律，影响食品中微生物生长的主要因素，食品中微生物控制的基本策略，灭菌、消毒、防腐等的异同。

第3页/共103页本章主要参考文献1．江汉湖主编：《食品微生物学》，中国农业出版社，2005年8月第2版。2．M.T.马迪根，J.M.马丁可，J.帕克著［美］.杨文博译.微生物学.北京：科学出版社，2001.3．周德庆.微生物学教程.北京:高等教育出版社，1993.

第4页/共103页生物个体由小到大的增长，即表现为细胞组分与结构在量方面的增加生长指生物个体数目的增加繁殖

在单细胞微生物中，生长繁殖的速度很快，而且两者始终交替进行，个体生长与繁殖的界限难以划清，因此实际上用群体生长作为衡量微生物生长的指标。

群体生长的实质是包含着个体细胞生长与繁殖交替进行的过程第5页/共103页测定微生物生长繁殖的方法微生物培养法概论微生物的生长规律影响微生物生长的主要环境因素有害微生物的控制内容提要

第6页/共103页测生长量计繁殖数测定生长繁殖的方法测定生长繁殖的方法微生物的纯培养第7页/共103页纯培养的分离方法

稀释倒平板法平板划线法选择培养基分离法单细胞挑取法第8页/共103页稀释倒平板法

第9页/共103页平板划线分离法

用接种环以菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。第10页/共103页3.单孢子或单细胞分离法

采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。在显微镜下使用单孢子分离器进行机械操作，挑取单孢子或单细胞进行培养。也可以采用特制的毛细管在载玻片的琼脂涂层上选取单孢子并切割下来，然后移到合适的培养基进行培养。第11页/共103页选择培养基分离法1.dilutesample1ml9ml10

1001000104105

106107牛肉膏培养基土豆培养基高氏培养基各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用这些特性可配制合适某种微生物而限制其它微生物生长的选择培养基，用它来培养微生物以获得纯培养。第12页/共103页微生物纯培养分离方法的比较分离方法应用范围平皿划线法方法简便，多用于分离细菌稀释倒平皿法即可定性，又可定量，用途广泛单细胞挑取法局限于高度专业化的科学研究利用选择培养基法适用于分离某些生理类型较特殊的第13页/共103页其他生理指标含N量法DNA/RNA法菌体内重要组成测定法测生长量称重量法N×6.25=Pr比浊法第14页/共103页重量法通过样品中蛋白质、核酸含量的测定间接推算微生物群体的生物量；测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法以干重、湿重直接衡量微生物群体的生物量；第15页/共103页比浊法测生长量(间接法)第16页/共103页计繁殖数直接计数法平板菌落计数法滤膜培养法各种型号的全自动血球计数仪第17页/共103页直接计数法a.直接法利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；第18页/共103页b.简接法原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。

第19页/共103页微生物的连续培养微生物的生长规律微生物的个体生长和同步生长单细胞微生物的典型生长曲线微生物的高密度培养第20页/共103页1.概念同步培养(synchronousculture)：是一种培养方法，它能使群体中不同步的细胞转变成能同时进行生长或分裂的群体细胞。同步生长：以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段，并同时进行分裂的生长方式同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。同步培养(synchronousculture)第21页/共103页同步培养方法

选择法诱导法离心方法过滤分离法硝酸纤维素滤膜法温度培养基成份控制光照和黑暗交替培养第22页/共103页硝酸纤维素滤膜法离心法第23页/共103页一、细菌群体生长规律

在不补充营养物质或移去培养物，保持整个培养液体积不变条件下，以时间为横坐标，以菌数为纵坐标，根据不同培养时间时细菌数量的变化，可以作出一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。生长曲线第24页/共103页生长曲线(growthcurve)描述细菌生长规律总菌数活菌数培养时间Ⅱ.指数期Ⅲ.稳定期Ⅳ.衰亡期Ⅰ.延滞期细菌数目（个/ml）对数ⅡⅢⅣⅠ第25页/共103页缩短延滞期的意义和方法延滞期(lagphase)出现原因本期特点影响本期限长短因素第26页/共103页延滞期出现原因

把细菌接种到新鲜的培养基中培养时，并不立即进行分裂繁殖，细菌增殖数为０，这时需要合成多种酶，辅酶和某些中间代谢产物，要经过一个调整和适应过程。第27页/共103页延滞期特点生长速率常数等于零菌体粗大

代谢活力强对不良条件抵抗能力降低ＲＮＡ含量增加第28页/共103页影响延滞期限长短因素接种龄接种量培养基成分第29页/共103页缩短延滞期的意义和方法可以缩短生产周期，提高设备利用率。接种对数生长期的菌种，采用最适菌龄

加大接种量用与培养菌种相同组成分的培养基第30页/共103页指数期(对数期)(exponentialphase)

特点该期的细菌生产中多被用做种子和科学试验材料①活菌数和总菌数接近②酶系活跃，代谢旺盛。③生长速率最大，generationtime最短。④细胞的化学组成及形态，生理特性比较一致第31页/共103页x2x1t2t1培养时间Lg细胞数/mlt2-t13.322(lgx2-lgx1)生长速率常数R=t2-t13.322(lgx2-lgx1)代时G=指数期生长的数学模型繁殖代数n=3.322(lgx2-lgx1)第32页/共103页影响指数期的因素菌种营养成分营养物浓度培养温度第33页/共103页稳定期(stationaryphase)出现原因

营养的消耗有害代谢产物积累PH值EH值等理化条件不适出现原因营养物比例失调第34页/共103页稳定期特点活菌数保持相对稳定，总菌数达最高水平。细菌代谢物积累达到最高峰。芽孢杆菌这时开始形成芽孢。这是生产收获时期。第35页/共103页衰亡期(declinephase/deathphase)特点细菌死亡数大于增殖数,活菌数明显减少,群体衰落细胞出现多形态,大小不等的畸形,变成衰退型细胞死亡,出现自溶现象。第36页/共103页三、连续培养

连续培养(continouscultureofmicroorganisms)是在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。

连续培养的基本原则：微生物培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物连续培养类型恒浊连续培养恒化连续培养第37页/共103页(一)恒化连续培养在整个培养过程中通过控制培养基中某种营养物质的浓度基本恒定的方式，保持细菌的比生长速率恒定，使生长“不断”进行。生长速率的控制因子：一般是氨基酸、氨和铵盐等氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源或者是无机盐，生长因子等物质恒化器连续培养通常用于微生物学的研究，筛选不同的变种。第38页/共103页第39页/共103页(二)恒浊连续培养通过连续培养装置中的光电系统控制培养液中菌体浓度恒定、使细菌生长连续进行的一种培养方式。用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业第40页/共103页第41页/共103页(三)连续发酵与单批发酵相比优点：缩短发酵周期，提高设备利用率；便于自动控制；降低动力消耗及体力劳动强度；产品质量较稳定；缺点：杂菌污染和菌种退化第42页/共103页连续培养(continuousculture)(openculture)将微生物置于一定容积的培养基中培养，最后一次收获，叫分批培养，将微生物放在恒定的容积的流动系统中培养称为连续培养。优点：缩短发酵周期；便于自动控制；产物质要量均一

缺点：菌种易退化；易染杂菌第43页/共103页微生物的高密度培养（highcell-densityculture,HCDC）指微生物在液体培养基中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术。现代高密度培养技术主要是用于基因工程菌生产多肽类药物。选取最佳培养基成分和各成分含量补料提高溶解氧的浓度防止有害代谢产物的生成第44页/共103页

影响微生物生长的主要环境因素氧化还原电位水分氧气温度辐射PH物理因素对微生物生长的影响化学因素对微生物生长的影响重金属及其化合物卤素有机化合物染料第45页/共103页温度生长速度温度停此生长致死最低最高最适嗜冷微生物（低温微生物）中温微生物嗜热微生物（高温微生物）低温对微生物的影响第46页/共103页嗜冷微生物（低温微生物）Ｅ系在低温下仍能起催化作用细胞膜含较多的不饱合脂肪酸在低温下仍具有通透性。上下班嗜冷机制：第47页/共103页嗜热微生物的嗜热机制细胞内的Ｅ具强抗热性产生的多胺，热亚胺和高温精胺物质对蛋白质等组织结构具有保护作用。一一一一一口口口核酸也具有热稳定性的保护结构。细胞膜含有较多的饱和脂肪酸和直链脂肪酸，使膜具有稳定性。上

第48页/共103页低温对微生物的影响代谢降低生长繁殖停滞仍然存活常在低温下对菌种和食品保藏。第49页/共103页PH影响细胞膜透性与稳定性影响物质溶解度影响细胞表面电荷分布因此影响微生物生长、繁殖，发育。各类微生物能够生长的PH值较宽，但细胞内部PH值却接近中性。微生物的活动也能改变环境中的PH值第50页/共103页嗜酸性微生物嗜碱性微生物耐酸及耐碱微生物根据氢离子浓度对微生物分类第51页/共103页氧气专性好氧菌（obligateorstrictaerobes）兼性厌氧菌（facultativeanaerobes）耐氧菌（aerotolerantanaerobes）厌氧菌（anaerobes）微好氧菌（microaerophilicbacteria）超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶

（Catalase

）第52页/共103页超氧化物歧化酶（SOD）功能：使好氧菌免受超氧化物阴离子自由基的毒害第53页/共103页2H2O2_Catalase_»2H2O+O2过氧化氢酶（Catalase

）第54页/共103页厌氧菌（anaerobes）将环境中氧吸掉；抽真空；深层培养氧对其有毒能量来源于发酵无氧呼吸环式光合磷酸化或甲烷发酵O2.-超氧阴离子自由基普遍存在H2O+1/2O2

过氧化氢酶（好氧菌）2H2O过氧化氢酶（耐氧菌）NADH2NADO2.+2H+H2O2+O2

-SOD（好氧菌及耐氧菌）1

1

1

细胞内缺泛SOD、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶A.

+

B.A:B

共价结合均裂第55页/共103页固体培养法液体培养法好氧菌的固体培养厌氧菌的固体培养好氧菌的液体培养厌氧菌的液体培养试管培养三角瓶（摇瓶）台式发酵罐高层琼脂柱厌氧培养皿Hungaterool-tubetechnique厌氧罐厌氧手套箱微生物培养法实验室培养法生产实践中的培养微生物装置固体培养法液体培养法好氧菌-曲法培养厌氧菌-堆积培养发酵罐（Fermenter）第56页/共103页..................Brewer皿.....................高层琼脂柱亨盖特技术第57页/共103页

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厌氧罐anaerobicjar第58页/共103页AnaerobicGloveBox第59页/共103页厌氧菌的培养第60页/共103页DifferentculturemethodsLiquidCultureBatchcultureBatch&Continuousculture10ml20ml-1L1L->1000LFermentor第61页/共103页挂曲小曲红曲近代人工踏制大曲AwholeprocessofDA-QUprepation第62页/共103页fermenter第63页/共103页fermenter第64页/共103页

有害微生物的控制几个基本概念物理灭菌因素的代表—高温化学杀菌剂、消毒剂和治疗剂第65页/共103页消毒(disinfection)：杀死或消除物体上的病原微生物的方法灭菌（sterilition）：杀死物体上全部微生物的方法防腐(antisepsis)：用理化方法防止抑制微生物生长的方法几个基本概念化疗(chemotherapy)：利用对病源菌具有高度毒力而对宿主基本无毒的化学物质来抑制宿主体内病源微生物的生长繁殖第66页/共103页高温灭菌辐射作用高渗作用干燥超声波控制微生物的物理因素第67页/共103页高温灭菌多数细菌，酵母菌和霉菌的营养细胞和病毒在50-65ºＣ10min可以致死。F

一般噬菌体65－80ºＣ致死，放线菌霉菌的孢子比营养细胞抗热性强，76－80ºＣ10min可以杀死B

细菌芽孢，在100ºＣ下５－20min才能致死，嗜热脂肪芽孢杆菌可在80ºＣ条件下生活，在120ºＣ，12min才能杀死，BBBBBBBBBBB同种微生物老龄菌比幼菌耐热。第68页/共103页高温灭菌干热灭菌(dryheatsterilization)湿热灭菌(mosistheatsterilization)

焚烧灭菌法：常用与废弃物动物尸体等处理。烘烤灭菌法；实验室用干燥箱烘烤接种工具。第69页/共103页湿热灭菌(mosistheatsterilization)

煮沸灭菌法（煮沸消毒法）高压蒸汽灭菌法间歇灭菌法巴斯德消毒法：（巴氏消毒法）该法比干热灭菌效果好，因为蛋白质在有水的情况下容易凝固，如含水50％，蛋白质凝固温度为56ºＣ；含水６％蛋白质凝固温度为160-170ºＣ第70页/共103页煮沸灭菌法（煮沸消毒法）物品在水中煮沸15min，可杀死所有营养细胞和一部分芽孢。在水中加入１％的Ｎa2CO3或２－５％的碳酸效果更好。此法适合注射器和解剖用具的消毒。第71页/共103页高压蒸汽灭菌(normalautoclving)是湿热灭中最好方法，通常在1.05kg/cm2,的压力下面（此时温度121ºＣ）处理15－30min。要排冷，否则会形成假压，虽然压力达到要求，温度却达不到相应高度，而影响灭菌效果。第72页/共103页间歇灭菌法(fractionalsterilization)是用常压蒸汽反复几次进行灭菌的方法。主要用于不宜高压灭菌的培养基，不耐热的药物和营养物等方法是将待灭菌物品置于蒸锅内加热到沸腾维持15-30min杀死营养细胞，取出冷却后在37ºＣ恒温培养24小时，使芽孢萌发，再用此法灭菌，反复三次，即可达到灭菌目的。第73页/共103页巴氏消毒法(pasteurization)是食品（牛奶）酿造（啤酒）工业中常用的方法。具体做法是61.7－62.8ºＣ处理30min或71.6ºＣ度处理15min，这样即可杀死病原微生物。又不致损坏营养，可保留食品饮料原有用味。根据结核杆菌在62ºＣ下15min被致死。低温维持法;高温瞬时灭菌第74页/共103页辐射可见光紫外线（非电离辐射）X射线与r射线第75页/共103页Ｏ２

紫外线０３０２＋｛O｝紫外线（非电离辐射）杀菌机制：诱导核酸形成胸腺嘧啶二聚体，从而干扰GGGGGGGG了核酸的复制H

第76页/共103页各种微生物对紫外线抗性干细胞强于湿细胞芽孢，孢子强于营养细胞多倍体＞二倍体＞单倍体第77页/共103页X射线与r射线直接学说间接学说r射线是放射性元素Co60发射出的高能射线，F

具强穿透能力，500－干伦琴剂量用于诱变育种，10万伦琴以上具杀菌作用。G

第78页/共103页高渗作用等渗溶液对微生物生长有利细菌处于低渗液中会吸水膨胀乃至破裂细胞处于高渗液中会脱水引起质壁分离导致死亡。J

第79页/共103页控制微生物的化学物质(因素)表面消毒剂抗代谢物抗生素化学治疗剂溶液状态气体状态生物药物素第80页/共103页酸和碱重金属极其盐类有机化合物氧化剂

卤素

染色剂表面活性剂表面消毒剂(surfacedisinfactant)第81页/共103页酸和碱

前面讲过微生物细胞中的DNA，RNA，Pr，E只有在中性条件下才能体现活性，因此强酸碱具杀菌作用。医院病房常用乙酸消毒。第82页/共103页重金属极其盐类是杀菌剂和防腐剂，作用最强的是Hg,Ag,Cu,作用机理：使蛋白质变性，使酶失活。（与E的－SH结合。）0·02－0·2％Hgcl2（升汞）溶液对大多数细菌有致死作用。CuSO4对真菌、藻类有强杀伤力，波尔多（CuSO4＋碳）防植物病害。另外还有砷，铋、锑的化合物是治疗梅毒的特效药。0·1－1％AgNO3可消毒皮肤，1％浓度新生儿点眼预防眼炎第83页/共103页有机化合物醇、醛、酚是常用的杀菌剂。杀菌机制①损伤细胞膜②使蛋白质变性（细胞膜，E失活）③抑制脱氢酶，氧化酶活性。第84页/共103页有机化合物甲醛：纯甲醛为气体，37－40％水液为福尔马林。醇是脱水剂蛋白质变性剂,70％乙醇杀菌效果最好。酚：3－5％的石碳酸溶液几分钟即可致死细菌甲酚杀菌力最强，煤酚皂液（来苏尔）为甲酚和肥皂的混合液。第85页/共103页氧化剂K2MnO4使菌体蛋白质氧化，使酶失活。777770·1－3％浓度可用于皮肤，果品、餐具、消毒。H2O2清洗伤口。第86页/共103页酪AA+I2→二碘酪氨酸

卤素

碘杀菌力强，3－7％碘溶于70－83％的乙醇中成碘酒。

氯及氯化物常用于水及食品消毒与水结合放出原子氧（O）用于消毒。上下氯，碘是常用的消毒剂第87页/共103页染色剂干扰菌体氧化还原电位阻碍芽孢的形成。第88页/共103页表面活性剂具有降低表面张力效应的物质叫表面活性剂。常用的有新吉尔灭等，去污剂，肥皂等。一落表面张力降低可抑菌或杀菌。五彩缤纷

第89页/共103页抗代谢物(antimetabolite)有些化合物在结构上与生物体所必需的代谢物很相似，以至可以和特定的酶结合，从而阻碍了酶的功能。干扰代谢的正常代谢。这些物质称为抗代谢物。叶酸磺胺类药物氨基酸5－甲基色氨酸吡哆醇异烟肼嘌呤6－巯基嘌呤抗代谢物代谢物第90页/共103页二氢蝶啶二氢蝶酸二氢叶酸四氢叶酸核酸氨基酸前体PABA酶①酶②酶③GluTMPCOOHH2NNH2SO2RCOOHH2NNH2SO2R磺胺药(sulphonamides,sulfadrugs)抑菌机理

TMP:三甲基苄二氨嘧啶