仪器分析第4讲高效液相色谱法

3-1高效液相色谱法的特点1.高效液相色谱法概述1960年代，由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易汽化的大分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。1960年代末科克兰、哈伯、荷瓦斯、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。

1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。现在是1页\一共有82页\编辑于星期二它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点．为了更好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面进行比较：一、概述现在是2页\一共有82页\编辑于星期二

1．高效液相色谱法与经典液相色谱法

高效液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化．液体的流动相高速通过时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对流动相施加高压15~35Mpa，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。现在是3页\一共有82页\编辑于星期二高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较

经典液相色谱法高效液相色谱法粒径(μm)75-6003-50（常用5-10）柱前压力(atm)0.01-1.020-300分析时间(h)1-200.05-1.0色谱柱长度(cm)50-2002-30柱效(块/m)2-50104-105样品用量(g)1-1010-6-10-2现在是4页\一共有82页\编辑于星期二2．高效液相色谱法与气相色谱法（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20％．对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析．

现在是5页\一共有82页\编辑于星期二

(2)高效GC1000塔板/m(填充柱）HPLC3W塔板/m现在是6页\一共有82页\编辑于星期二(3)气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作．总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展．现在是7页\一共有82页\编辑于星期二高效液相色谱与气相色谱的比较

GCHPLC应用范围热稳定、低沸点的物质热不稳定、高沸点、离子型的物质热力学理论较成熟正在发展中分析成本低高分离能力与柱的类型有关较高现在是8页\一共有82页\编辑于星期二液相色谱仪器

highperformanceliquidchromatograph现在是9页\一共有82页\编辑于星期二3.高效液相色谱法的应用

1.药物分析

约80%的药物都能用高效液相色谱进行分离和纯化。特别是手性药物的分离分析。2.食品分析①食品本身组成,特别是营养成分，如糖、有机酸、维生素、蛋白质、氨基酸、脂肪的分析；②食品添加剂，如防腐剂、抗氧化剂、合成色素、甜味剂和保鲜化学物质的分析；③食品污染物，如农药残余和黄曲霉素等的分析。

3.制备分离应用

要制备或提取一些高纯化合物，如新合成化合物的结构鉴定，药物的生物和毒理试验。现在是10页\一共有82页\编辑于星期二4.高效液相色谱法的特点高压（150×105~350×105Pa）高速（in1hr）高效（3w/m)高灵敏度(UV-ng;FL-10pg;μTAS)现在是11页\一共有82页\编辑于星期二人参、西洋参与三七的鉴别R1Rg1ReRb1RdABCRg1Rg1ReReRfRb1RcRb2RdRc三种药材的HPLC指纹图谱现在是12页\一共有82页\编辑于星期二3-2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素H=A+B/μ+Cμ高效液相色谱中的速率方程现在是13页\一共有82页\编辑于星期二高效液相色谱中的速率方程涡流扩散项纵向扩散流动相传质滞留区传质固定相内传质现在是14页\一共有82页\编辑于星期二2.对速率方程的讨论选用细颗粒填料可获高柱效（5μm）流动相流速低，有利于达到高柱效选用黏度小的流动相有利于提高柱效温度的影响(适当提高柱温以降低流动相黏度）液膜厚度的影响现在是15页\一共有82页\编辑于星期二3.柱外效应由于色谱柱之外的因素引起的色谱峰的展宽，例如进样系统、连接管路及检测器的死体积等。现在是16页\一共有82页\编辑于星期二3-3高效液相色谱的类型及其分离原理

液—液分配色谱及化学键合相色谱液—固吸附色谱离子交换色谱离子色谱空间排阻色谱

现在是17页\一共有82页\编辑于星期二流动相和固定相都是液体分离原理：利用组分在两相中溶解度的差异固定相：载体+固定液早期物理或机械法涂渍固定液，由于易流失已较少采用；现在应用最广的是化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到担体（硅胶）表面的游离羟基上。

liquid-liquidpartitionchromatography1、液-液分配色谱现在是18页\一共有82页\编辑于星期二液—液分配色谱固定液类型：β,β’—氧二丙腈、聚乙二醇、角鲨烷等。液—液色谱流动相应尽可能不与固定液互溶，两者的极性差别应很大。固定液为极性、流动相为非极性的液—液色谱称为正相色谱，反之，则称为反相色谱。现在是19页\一共有82页\编辑于星期二

正相色谱——固定液极性>流动相极性（NLLC）

极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱适于分离极性组分

反相色谱——固定液极性<流动相极性（RLLC）

极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适于分离非极性组分液液分配色谱法现在是20页\一共有82页\编辑于星期二液—液分配色谱应用：液—液色谱能分离多种类型化合物，如烷烃、烯烃、芳烃、染料、甾族化合物等。

现在是21页\一共有82页\编辑于星期二利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面1．分离原理：分配+吸附（以LLC为基础）2．特点：不易流失热稳定性好化学性能好载样量大适于梯度洗脱化学键合固定相（chemicallybondedphasechromatography）现在是22页\一共有82页\编辑于星期二分离原理：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异

分离前提：K不等或k不等流动相为液体，固定相为固体吸附剂2、液-固吸附色谱

liquid-solidadsorptionchromatography现在是23页\一共有82页\编辑于星期二液—固吸附色谱固体吸附剂主要类型：极性的硅胶（应用最广）氧化铝分子筛非极性的活性炭现在是24页\一共有82页\编辑于星期二液—固吸附色谱应用：分离极性不同的试样分离含极性基团相同但数目不同的试样分离异构体现在是25页\一共有82页\编辑于星期二3、离子交换色谱

ion-exchangechromatography

固定相：阴离子或阳离子交换树脂；

流动相：阴离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；

基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；阳离子交换：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

阴离子交换：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-

应用：离子及可离解的化合物，包括氨基酸、核酸等。现在是26页\一共有82页\编辑于星期二离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景电导信号掩没而无法检测。为了解决这一问题，1975年Small等人提出一种能同时测定多种无机和有机离子的新技术。4、离子色谱

ionchromatography现在是27页\一共有82页\编辑于星期二离子色谱应用：待测阴离子随流动相通过离子交换树脂时发生离子交换反应。至今离子色谱是分离分析常见无机混合阴离子的最佳分析方法。现在是28页\一共有82页\编辑于星期二现在是29页\一共有82页\编辑于星期二5、空间排阻色谱（凝胶色谱）

size-exclusionchromatography固定相：凝胶gel具有一定大小孔隙分布。

原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子非常小，故在最后出峰。整个试样都在tM(死时间）之前出峰。现在是30页\一共有82页\编辑于星期二空间排阻色谱法特点：峰扩展比较小流动相和固定相的选择比较简单不能分离异构体（>10%）可对相对分子质量在100-8*105范围内的化合物按质量分离现在是31页\一共有82页\编辑于星期二液相色谱分离类型的选择（1）根据相对分子质量选择相对分子质量十分低的样品，其挥发性好，适用于气相色谱．标准液相色谱类型（液--固、液--液、及离子交换色谱）最适合的相对分子质量范围是200～2000．对于相对分子质量大于2000的样品，则用尺寸排阻法为最佳．现在是32页\一共有82页\编辑于星期二（2）根据溶解度选择如：样品可溶于水并属于能离解物质，以采用离子交换色谱为佳；如：样品可溶于烃类（如苯或异辛烷），则可采用液--固吸附色谱

现在是33页\一共有82页\编辑于星期二（3）根据分子结构选择例如，酸、碱化合物宜用离子交换色谱；脂肪族或芳香族宜用液--液分配色谱或液--固吸附色谱；异构体用液--固吸附色谱；同系物用液--液分配色谱．等等。现在是34页\一共有82页\编辑于星期二分离类型选择总结，P93现在是35页\一共有82页\编辑于星期二3-4液相色谱法固定相

高效液相色谱柱是HPLC的心脏。左右心房分别是：固定相和其填装技术（－）固定相高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类．

刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.O×108～1.O×109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒．现在是36页\一共有82页\编辑于星期二

（2）全多孔型

由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用5~10μm的小颗粒，比表面积和柱容量都很大。

（1）表面多孔型

基体是30~40μm实心玻璃微球，表面附着一层厚度为1~2μm的多孔活性材料，如硅胶、氧化铝等。表面积小，柱容量低。固定相按照空隙深度分类：现在是37页\一共有82页\编辑于星期二1、液液色谱法、键合相色谱法及离子对色谱法固定相1）全多孔型单体（porousmicrobeadssupport）2）表层多孔型担体（pellicularmicrobeadssupport）现在是38页\一共有82页\编辑于星期二化学键合固定相（1960后）在硅胶表面利用硅烷化反应制得Si-O-Si-C型的反应该化学键稳定，是广泛使用的固定相（C-18）。现在是39页\一共有82页\编辑于星期二类型分离方式应用特点C-18反相、离子对普适性好，保留值大。溶于水的高极性化合物、中等极性化合物C-8反相、离子对与C-18类似，保留值略小C-3,C-4反相保留值小，适合肽类和蛋白质苯基反相保留适中，选择性不同。非极性、中等极性化合物-CN反相、正相选择性与硅胶类似，保留小，用途广-NH2反相、正相分离糖类、核苷酸、固醇等二醇基正相分离有机酸、排阻分蛋白质等醚基反相、正相分离酚类、芳硝基化合物，保留比C-18强聚苯乙烯基反相pH使用范围广，对部分分离峰形好，寿命长常用固定相表3-2现在是40页\一共有82页\编辑于星期二化学键合固定相特点表面没有液坑，传质快无固定液流失可以改变选择性（通过键合不同官能团）有利于梯度洗提，及配用灵敏的检测器现在是41页\一共有82页\编辑于星期二2．液固吸附色谱法固定相（2）高分子多孔小球：YSG

原理：吸附+分配蒹小孔凝胶作用特点：柱选择性好，峰形好，柱效低适用：分离弱极性化合物（1）硅胶

表孔硅胶（薄壳硅胶）全多孔硅胶无定形YWG5~6μm5×104球形YQG3~4μm8×108

堆积硅珠YQG3~4μm8×108理想

原理：吸附特点：峰易拖尾适用：分离极性化合物现在是42页\一共有82页\编辑于星期二在气相色谱中，载气是惰性的，常用的只有三四种，他们的性质差异也不大，所以要提高柱子的选择性，只要选择合适的固定相即可。但在液相色谱中，当固定相选定后，流动相的种类、配比能显著的影响分离效果，因此，流动相的选择也非常重要。液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。3-5液相色谱法流动相

现在是43页\一共有82页\编辑于星期二

流动相的选择原则流动相纯度要高（色谱纯）且价格便宜应避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂对试样要有适宜的溶解度溶剂的粘度要小些为好应与检测器相匹配现在是44页\一共有82页\编辑于星期二常用溶剂的极性顺序：

水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六环>四氢呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>异丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)

在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。例如，采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据现在是45页\一共有82页\编辑于星期二高效液相色谱仪3-6高效液相色谱仪现在是46页\一共有82页\编辑于星期二高效液相色谱仪：贮液器、高压泵、梯度洗提装置、进样器、色谱柱、检测器、恒温器和色谱工作站等。主要工作部件现在是47页\一共有82页\编辑于星期二1.高压泵色谱柱很细1-6mm，填充剂粒度小5-10μm，阻力很大

要求：流量稳定，压力平稳无脉动（1）往复式柱塞泵（2）气动放大泵恒流泵和恒压泵两类现在是48页\一共有82页\编辑于星期二2.梯度洗提梯度洗提即程序控制流动相的组成，使在整个分离过程中，溶剂强度按照特定的变化规律增加。

优点：分离复杂混合物，使所有组分都处在最佳的k值范围内。

缺点：检测器的使用受到限制，分析结果的重复性取决于流速的稳定性。柱子需进行再生处理。现在是49页\一共有82页\编辑于星期二应用举例现在是50页\一共有82页\编辑于星期二3.进样装置注射器进样装置高压定量进样阀现在是51页\一共有82页\编辑于星期二旋转式六通阀

六通进样阀结构示意图现在是52页\一共有82页\编辑于星期二

高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。进样系统是引起往前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。

进样阀现在是53页\一共有82页\编辑于星期二色谱柱是液相色谱仪的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分．柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属．玻璃管耐压有限，故金属管用得较多，目前标准色谱柱长15～30cm，内径为4.6mm或3.9mm，直型不锈钢柱4.分离系统——色谱柱现在是54页\一共有82页\编辑于星期二

柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（＜20μm）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。现在是55页\一共有82页\编辑于星期二液相色谱柱发展趋势减小填料颗粒度（3~5μm），提高柱效；可以使用更短的柱（数cm），加快分析速度;减小柱径（内径<1mm),降低溶剂用量又提高检测浓度现在是56页\一共有82页\编辑于星期二5．检测器

紫外检测器荧光检测器示差折光检测器电导检测器现在是57页\一共有82页\编辑于星期二5．检测系统

在液相色谱中，有两种基本类型的检测器．一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等．另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等．现在是58页\一共有82页\编辑于星期二理想的检测器特性灵敏度高重现性好响应快线性范围宽适用范围广对流动相流量和温度波动不敏感死体积小现在是59页\一共有82页\编辑于星期二(1)

紫外－可见检测器

应用最广，适用于对紫外可见光有吸收的样品的检测。对大部分有机化合物有响应。其结构同紫外－可见分光光度计。

现将常用的检测器介绍如下:现在是60页\一共有82页\编辑于星期二紫外检测器

应用最广，对大部分有机化合物有响应。现在是61页\一共有82页\编辑于星期二响应特性选择性检测器，如芳烃类化合物的检测灵敏度高，可检测10-9g/mL的物质线性范围宽，104-105对温度及流动相的改变不敏感适合梯度洗提HPLC常规检测器现在是62页\一共有82页\编辑于星期二示差折光检测器示差折光检测器是依据不同性质的溶液对光具有不同的折射率，通过连续测量溶液折射率的变化，便可测知各组分的含量。

现在是63页\一共有82页\编辑于星期二示差折光检测器

（differentialrefractiveindexdetector）

除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；

通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种现在是64页\一共有82页\编辑于星期二响应特性通用型的浓度检测器低灵敏度（10-7g/mL)基线易受温度的影响（温度精密度±10-3℃）不适合梯度洗提现在是65页\一共有82页\编辑于星期二荧光检测器（fluorescencedetector）根据某些物质受激后能产生一定强度荧光的性质，可制成灵敏度极高的荧光检测器。

现在是66页\一共有82页\编辑于星期二响应特性选择性检测器。对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。高灵敏度，比紫外高约1000倍适合梯度洗提现在是67页\一共有82页\编辑于星期二荧光检测器结构现在是68页\一共有82页\编辑于星期二应用举例现在是69页\一共有82页\编辑于星期二电导检测器结构离子色谱法中使用最广的检测器原理：根据物质在某些介质中解离后所产生的电导变化来进行测定现在是70页\一共有82页\编辑于星期二响应特性选择性检测器，对离子型化合物有响应灵敏度高受温度的影响不能梯度洗提现在是71页\一共有82页\编辑于星期二3-7HPLC分离类型的选择选择合适的液相色谱分离类型

了解分析对象要分析的组分的大致浓度干扰物质试样的性质化学结构分子量极性、酸碱性溶解度参数现在是72页\一共有82页\编辑于星期二色谱分离方式的选择

根据相对分子质量选择根据溶解性选择根据分子结构选择

现在是73页\一共有82页\编辑于星期二根据相对分子质量选择相对分子质量低的试样(≤400)因其挥发性强，宜采用气相色谱分离；相对分子质量大于2000的化合物可采用液相色谱分离；相对分子质量介于400—2000范围内的分子，应视试样性质选用液—固吸附色谱、液—液分配色谱或离子交换色谱分离。现在是74页\一共有82页\编辑于星期二根据分子结构选择

液—固吸附色谱适用于异构体分离；液—液分配色谱可用于同系物分离；含有离子基团和能电离基团的组分，可采用离子交换色谱分离；生物大分子或高分子聚合物可用空间排阻（凝胶）色谱分离。现在是75页\一共有82页\编辑于星期二根据溶解性选择水溶性离子化合物与共价化合物可分别采用离子交换色谱或液—液分配色谱分离。对于非水溶性化合物，若易溶于烃类溶剂，可采用液—固吸附色谱分离；若溶于二氯甲烷或氯仿，可采用液—固吸附色谱或正相液—液分配色谱分离；若溶于甲醇，则用反相液—液分配色谱分离。现在是76页\一共有82页\编辑于星期二溶于水——排阻色谱，水为流动相相对分子质量＞2000不溶于水——排阻色谱，非水流动相同系物——键合相色谱不溶于水异构体——液固色谱样品分子大小差异——排阻色谱