二动物细胞工程

二动物细胞工程动物细胞工程其中，动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。动物细胞工程

常用的技术手段动物细胞培养动物细胞融合单克隆抗体胚胎移植核移植2020/11/32

烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人？思考？2020/11/33取该患者的皮肤进行细胞培养,获得人造皮肤后再移植2020/11/34（一）、概念是指从动物机体内取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。（二）、原理细胞分裂增殖一、动物细胞培养2020/11/35(三)、动物细胞培养过程（示意图）

幼龄动物取动物器官和组织剪碎组织胰蛋白酶处理细胞培养单个细胞动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础剪碎组织的目的？胰蛋白酶处理的目的？2020/11/36（四）动物细胞生长特性细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。

要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑无毒、易于贴附。接触抑制2020/11/37接触抑制：细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，最后形成一个单层，此时细胞间相互接触，细胞分裂和生长停止，数量不再增加。50代以后失去接触抑制接触抑制2020/11/38原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞，这个过程称为原代培养。传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。（分瓶培养的过程）2020/11/393.培养过程：动物胚胎或幼龄动物的细胞、组织或器官细胞悬浮液→原代培养

（遗传物质不变）细胞株

细胞系传代培养10代细胞50代细胞无限传代单个细胞胰蛋白酶加培养液剪碎细胞贴壁剥离分瓶部分细胞“癌变”，遗传物质改变，无限传代动物细胞培养不能最终培养成动物体接触抑制2020/11/310培养器皿2020/11/311

超净工作台实验设备细胞培养箱倒置显微镜2020/11/312（五）、动物细胞培养条件1、无菌、无毒的环境（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）2、营养（葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等）3、温度和PH温度36.5+0.5度，pH7.2～7.44、气体环境O2和CO2（95%空气和5%CO2）2020/11/313思考与讨论1、动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因？2、用胰蛋白酶分散细胞，由此可说明细胞间的物质主要是什么成分？3、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？那将动物组织分散成单个细胞时要注意什么问题呢？4、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？因为这些组织或器官，分裂能力旺盛，易于培养。主要是蛋白质(胶原蛋白等)。能，应注意时间的控制不能，因为动物细胞培养适宜的PH为7.2—7.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。2020/11/3146、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组织培养基有何独特之处？5、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？7、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。独特之处有：1、液体培养基2、成分中有动物血清等成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体2020/11/315植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目植物组织培养动物细胞培养原理细胞的全能性细胞增殖培养基性质固体培养基液体培养基培养基特有成分蔗糖植物激素葡萄糖动物血清培养结果植物体细胞株、细胞系培养目的快速繁殖、培育无病毒植株获得细胞或细胞分泌蛋白2020/11/316生产蛋白生物制品：病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等健康细胞培养：如获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮。用于检测有毒物质用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据（六）、动物细胞培养技术的应用2020/11/317检测有毒物质（许多致畸、致癌物质加入培养液后，培养细胞会发生染色体结构和数目的变异。根据变异细胞占全部培养细胞的百分数，可以判断某种物质的毒性。）为烧伤病人植皮（利用动物细胞培养技术中细胞的贴壁生长和接触抑制特点，可以用烧伤病人自己的健康皮肤细胞培养出大量的自身薄层皮肤细胞供植皮所需。）2020/11/318

动物细胞特点？分化潜能变窄：随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能变窄，这是指整体细胞而言。细胞核仍具有全能性：细胞核，它含有保持物种遗传性所需的全套基因，而且并没有因细胞分化而丢失基因，因此高度分化细胞的细胞核仍具有全能性2020/11/3191970年，有两位科学家做了一个著名的实验：人—鼠细胞融合的实验，以证明细胞膜上的蛋白质分子是运动的。人—鼠细胞是怎样实现融合的？动物细胞融合有什么实践意义呢？2020/11/320二、动物细胞融合

细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合受精作用2020/11/321

动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程，融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞称为杂交细胞。1.动物细胞融合的概念：2020/11/322灭活病毒诱导细胞融合的原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏这些病原体的抗原结构。2020/11/323正在融合的淋巴细胞与骨髓瘤细胞正在融合的鸡血细胞2.动物细胞融合的原理：细胞膜的流动性2020/11/324细胞A细胞B杂种细胞生物法：灭活的病毒电激←物理法聚乙二醇←化学法（如仙台病毒）丧失感染活性

（不感染细胞）保留融合活性

（诱导细胞融合）灭活仙台病毒紫外线动物细胞融合操作过程图解：2020/11/325用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程图细胞核病毒颗粒细胞核2020/11/326植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较细胞融合原理融合方法诱导手段用途植物

体细胞

杂交细胞膜的流动性去除细胞壁后诱导原生质体融合离心、电刺激、振动、显微操作、聚乙二醇等试剂诱导克服远源杂交不亲和，获得杂交植株动物

细胞

融合使细胞分散后诱导细胞融合同上，再加上灭活的病毒诱导制备单克隆抗体的技术之一2020/11/3273.动物细胞融合技术的应用：⑴意义：突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能；

⑵用途：为制造单克隆抗体开辟了新途径。

2020/11/3281.抗体是由何种细胞产生的？

效应B细胞（浆细胞）。2.一个Ｂ淋巴细胞(浆细胞)能分泌多种抗体吗？

每一个Ｂ淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。3.一种抗原侵入机体之后，引起机体免疫反应产生的抗体只有一种吗？

动物在免疫反应过程中，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上。4.简述获得抗体的传统途径？

抗原动物体抗体抗原不纯抗体不纯三、单克隆抗体刺激浆细胞2020/11/329抗体的传统生产方法抗原反复注射动物从动物的血清中分离抗体该法制备抗体的缺点：产量低、纯度低，且抗体的特异性差、灵敏度低。如何解决这个问题呢？单克隆抗体！2020/11/3306.如何获得化学性质单一、特异性强的抗体？

体外培养单个Ｂ淋巴细胞，提取分泌的抗体7.体外培养淋巴细胞能无限增殖吗怎样解决这个问题？5.这种方法获得的抗体有什么缺陷？

产量低，纯度低，特异性差2020/11/331单克隆抗体：杂交瘤细胞经无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。

特点：特异性强、灵敏度高

单克隆抗体技术2020/11/332概括单克隆抗体的概念单：单个细胞克隆:无性繁殖抗体:化学性质单一、特异性强2020/11/333技术原理：4）动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞（获取大量单克隆抗体）1）单个B淋巴细胞产生单一抗体（但不能无限增殖）2）肿瘤细胞能无限增殖（但不能分泌单一抗体）3）细胞融合技术杂交瘤细胞（既无限增殖又分泌单一抗体）2020/11/334一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体骨髓瘤细胞能无限增殖杂交瘤细胞动物细胞培养技术设计方案：动物细胞融合技术单克隆抗体既能产生特异性抗体，又能大量增殖的细胞1975年科学家米尔斯坦(阿根廷）和柯勒（德国）的实验2020/11/335单克隆抗体的制备抗原注入小鼠体内骨髓瘤细胞分离B淋巴细胞细胞融合杂交瘤细胞细胞培养选择培养细胞注入小鼠体内培养培养基体外培养从腹水提取从培养液提取单克隆抗体能产生抗体能无限增殖既能产生抗体又能无限增殖2020/11/336单克隆抗体的制备2020/11/337免疫小鼠培养骨髓瘤细胞融合骨髓瘤细胞B淋巴细胞注射特定抗原蛋白选择培养基上培养专一抗体检验阳性注射到小鼠体内体外培养单克隆抗体克隆杂交细胞分开不同杂交细胞，克隆专一抗体，检验阳性细胞

单克隆抗体制备过程示意图多种杂交细胞2020/11/3382020/11/339①为什么给小鼠注射特定的抗原蛋白？②会有几种融合方式？③杂交瘤细胞是如何筛选出来的？有何特点？④是否所有的杂交瘤细胞都能产生专一性抗体？⑤如何大规模进行培养得到大量的单克隆抗体？2020/11/340BB、B瘤、瘤瘤（B、瘤）（一选）选择性培养基：只有杂交瘤细胞才能存活获得产生相应抗体的B细胞（二选）：选能产生所需专一抗体的杂交瘤细胞√体外培养小鼠腹腔内培养杂交瘤细胞特点：既能产生特异性抗体，又能大量增殖。2020/11/341整个制备过程为何要经过两次筛选第一次筛选：用特定的选择培养基筛选出多种杂交瘤细胞第二次筛选（克隆化培养和抗体检测）：筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞。2020/11/342单克隆抗体的制备——体外培养法，动物体内诱生法？

小鼠腹腔内有自然吞噬作用，避免污染；小鼠腹腔本身为杂交瘤的良好培养环境，使杂交瘤细胞始终处于对数生长状态。体外培养法——大规模生产体内培养法——小规模生产2020/11/343单克隆抗体筛选杂交细胞杂交瘤细胞体外或体内细胞培养筛选骨髓瘤细胞诱导细胞融合特异性杂交瘤细胞杂交瘤细胞系提取经过免疫的B淋巴细胞动物细胞融合技术动物细胞培养技术单克隆抗体的制备过程小结：特点：既能产生专一抗体又能大量繁殖特点：特异性强灵敏度高可大量制备注射抗原免疫2020/11/344单克隆抗体的应用１.作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质，并与抗原特异性结合2.用于运载药物：制成“生物导弹”治疗肿瘤治疗疾病：主要用于癌症治疗优点：准确、高效、简易、快速单克隆抗体的优点：特异性强、灵敏度高优点:疗效高、毒副作用小2020/11/3454、单抗隆抗体的应用①作为诊断试剂②定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病

用于体外诊断人类和动植物疾病及病原鉴定，纯度高、特异性强，具有准确、高效、简易、快速的优点。③用于治疗疾病和运载药物

利用同位素标记单抗，在特定组织成像

制成生物导弹，将药物定向带到癌细胞所在的位置，在原位杀死癌细胞，疗效高、副作用小。单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并可以大量制备。2020/11/3462020/11/347

2020/11/348用于治疗疾病和运载药物①特异性强、灵敏度高

生物导弹——单克隆抗体＋抗癌药物

②疗效高、毒副作用小结合同位素的单抗-----生物导弹2020/11/349结合同位素的单抗-----生物导弹单抗放射性同位素2020/11/350哺乳动物的胚胎移植哺乳动物如牛、羊等，妊娠时间长，每胎产子数少，繁殖速度比较慢。利用哺乳动物的胚胎移植技术，可以快速繁殖优良动物品种，为畜牧业的发展带来了光明的前景。同时，这一技术也可以用于解决人类不育症问题。胚胎移植的过程：以优良种牛的繁殖为例，科学家们首先用激素促进良种母牛多排卵，然后把卵细胞从母牛体内取出，在试管内与人工采集的精子进行体外受精，培育成胚胎，再把胚胎送入经过激素处理、可以接受胚胎植入的母牛子宫内，孕育成小牛产出。用这种方法得到的小牛叫做试管牛。利用胚胎移植技术可以使每头良种母牛一年繁殖牛犊上百头。2020/11/351教学反馈1.动物细胞融合技术最重要的用途是（）A.克服远源杂交不亲和B.制备单克隆抗体C.培育新物种D.生产杂种细胞B2.单克隆抗体是由下列哪种细胞产生的 （）

A.B淋巴细胞B.T淋巴细胞C.骨髓瘤细胞D.杂交瘤细胞

D3.（多选）1975年米尔斯坦和柯勒成功地获得了单克隆抗体。下列细胞中与单克隆抗体的制备有关的是 （）

A.效应B细胞B．T淋巴细胞

C.骨髓瘤细胞D．杂交瘤细胞

ABCD2020/11/352课后习题5.单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（）①淋巴细胞②小鼠骨髓瘤细胞③B淋巴细胞自身融合细胞④小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞⑤杂交瘤细胞A.②④B.①③⑤C.①②③④D.②③C6.动物细胞融合和植物原生质融合决定于()

A.细胞膜的流动性B．细胞膜的选择透过性

C.细胞质的流动性D．细胞质酶的活性A2020/11/3537.“生物导弹”是指 （）A.单克隆抗体B.杂交瘤细胞C.产生特定抗体的B淋巴细胞D.在单克隆抗体上连接抗癌药物

D8.只能使动物细胞融合的常用诱导方法是 （）A．PEGB．灭活的病毒C．电刺激D．离心B二.简答题1.淋巴细胞是由动物体---------------------中的---------------------细胞分化发育而来的。2.杂交瘤细胞从培养基中吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是---------------------骨髓造血干主动运输2020/11/3541.动物细胞工程技术的基础是：A．动物细胞融合 B．胚胎移植C．动物细胞培养D．核移植练一练2020/11/355２．在动物细胞融合和植物体细胞