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文档简介

质粒DNA的小量制备基础植物生物技术提纲目的1原理2材料3方法4注意事项5一、目的掌握一种较常用的提取质粒DNA的方法三、材料(一)仪器

超净工作台；隔水式电热恒温培养箱；摇床；2102型分光光度计；Eppendorf5417C常温高速离心机；XW-80型旋涡混合器；电热恒温水浴锅；低温冰箱(-20℃)～-70℃)；稳压电泳仪(0～500V，0～300mA)；Chemi-Smart2000/3000型化学发光及凝胶成像系统；(二)器皿

刻度摇菌管，微量移液器，标记笔,EP管(三)菌种

大肠杆菌DH-5α中的Hm质粒(四)培养基

LB液体培养基：蛋白胨10克﹑酵母提取物5克和氯化钠10克用蒸馏水溶解至1000毫升，用10mMNaOH调至pH7.2-7.4,湿热灭菌20分钟。

三、材料(五)试剂

1．溶液I[50mM葡萄糖10mMEDTA25mMTris-HCI(pH8.0)]配制方法

：吸取母液1M葡萄糖2.5毫升;0.5MEDTA1毫升;1MTris-HCI

(pH8.0)12.5毫升,加无菌水至50毫升2．溶液Ⅱ[0.2MNaOH；1％SDS]配制方法：1M

NaOH

2毫升﹑10％

SDS1毫升加无菌水至10毫升3．溶液Ⅲ[KAC(pH4.8)缓冲溶液]配制方法：5MKAC

60毫升﹑冰醋酸

11.5毫升加无菌水至100毫升三、材料(五)试剂7.Tris饱和酚8.氯仿-异戊醇(24:1)：取240毫升氯仿，加入10毫升异戊醇,充分混匀9.预冷无水乙醇：无水乙醇保存在-20℃冰箱中备用。10.TAE电泳缓冲液：40mMTris-HCI(pH8.0)、20mMNaAC、2mMEDTA。三、材料(五)试剂11.溴酚蓝指示剂溶液：0.2％溴酚蓝、40％蔗糖配制方法：0.2克溴酚蓝、40克蔗糖用100毫升无菌水充分溶解，4℃保存。12.0.8%琼脂糖制备配制方法：用100毫升TAE电泳缓冲液加上0.8克琼脂糖加热完全溶解后，加入6微升10毫克/毫升EB于45℃倒入插有点样梳的制胶槽。三、材料四、方法1．取平板活化后的菌落接种于含50毫克／升Kan的LB液体培养基，37℃振荡培养过夜。

平板活化震荡培养

接种于LB培养基加50毫克/升Kan四、方法3．取沉淀，重悬于100微升溶液I，于XW-80型旋涡混合器上完全分散，室温放置5分钟；

4．加人新配的溶液Ⅱ200微升，盖紧管口,立即反复倒置5次，室温放置5分钟；5．加入溶液Ⅲ150微升，倒置混匀，于冰上放置10分钟；加溶液I加溶液Ⅱ

加溶液Ⅲ

6．12000rpm离心10分钟，取上清，计算体积；7．加入等体积的酚和氯仿-异戊醇(24:1)，混合后于12000rpm离心10分钟，取上清，加入1.5毫升EP管，计算体积；8．加人2倍体积预冷无水乙醇沉淀核酸，室温放置10分钟；四、方法加氯仿-异戊醇加无水乙醇9．12000rpm离心10分钟、小心除去上清，将离心管倒置于纸巾上；10．加7

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