北科大微生物培养基的配制及灭菌

北科大微生物培养基的配制及灭菌第1页，共22页，2023年，2月20日，星期三肉膏蛋白胨培养基是一种广泛用于培养细菌的培养基，属于天然培养基（complexmedia,undefinedmedia）。其主要成分是牛肉膏、蛋白胨和NaCl。它们分别提供微生物生长繁殖所需要的碳源、氮源、能源、生长因子和无机盐等。配天然培养基时可以用自来水，但自来水中常含Ca2＋，Mg2＋离子，可与其他成分形成沉淀。肉膏蛋白胨培养基第2页，共22页，2023年，2月20日，星期三高氏合成一号培养基是一种用于培养放线菌的合成培养基(definedmedia)。培养基中的可溶性淀粉作为碳源和能源，KNO3作为氮源，K2HPO4、MgSO4和FeSO4作为无机盐（高价阳离子盐需单独灭菌后临用前与含磷酸盐的培养基混匀）。合成培养基必须用蒸馏水高氏合成一号培养基第3页，共22页，2023年，2月20日，星期三豆芽汁葡萄糖培养基是培养酵母菌及霉菌的一种优良培养基，为半合成培养基(semi-definedmedia)。培养基配方出现的自然pH系指培养基不经酸、碱调节而自然呈现的pH。豆芽汁葡萄糖培养基第4页，共22页，2023年，2月20日，星期三马丁培养基是选择培养基，属于半合成培养基，常用于从自然环境中分离真菌，其中的孟加拉红能抑制细菌和放线菌的生长，而对于真菌的生长则没有影响，另外，在使用前，向培养基中加入去氧胆酸钠和链霉素(30u/ml)。去氧胆酸钠为表面活性剂，防止霉菌菌丝蔓延，还可抑制G+细菌生长；链霉素对多数G－细菌具抑制生长作用。从而达到分离真菌的目的。马丁培养基第5页，共22页，2023年，2月20日，星期三产葡萄糖氧化酶菌株的筛选培养基葡萄糖氧化酶（GlucoseOxidase，E.C.1.1.3.4，简称GOD）

O2+C6H12O6+H2OC6H12O7+H2O2GOD葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶在生化检测（葡萄糖）、面粉处理（过氧化氢对半胱氨酸的作用形成二硫键）、食品保鲜（去除氧气）等领域具有广泛应用。第6页，共22页，2023年，2月20日，星期三培养基——葡萄糖氧化酶平板筛选培养基(g·L-1)：

葡萄糖80，蛋白胨3，(NH4)2HPO40.39，KH2PO40.19，MgSO4·7H2O0.16，CaCO33.5，可溶性淀粉10，KI1.7，脱氧胆酸钠0.2，琼脂20，硫酸链霉素25000U。

葡萄糖氧化酶第7页，共22页，2023年，2月20日，星期三产葡萄糖氧化酶的微生物大多为霉菌。加入脱氧胆酸钠是为了抑制菌丝的形成以获得不互相粘连的霉菌菌落。加入硫酸链霉素是为了抑制细菌的生长。葡萄糖氧化酶催化葡萄糖会生成葡萄糖酸，pH下降，可以通过CaCO3控制培养基的pH，并形成透明圈。葡萄糖氧化酶催化葡萄糖会生成过氧化氢，可以氧化KI生成I，使淀粉变色，从菌落周围是否出现特异的淀粉蓝色圈可以判断出该菌是否产酶。第8页，共22页，2023年，2月20日，星期三培养方法——葡萄糖氧化酶土壤霉菌分离：取土壤样品5g，加入95mL的无菌水中，200r·min-1摇床振荡1h。平板筛选培养：采用Fiedure.K.J显色法。将富集培养后的土壤悬液，按不同稀释度（10-2、10-3、10-4）接种于平板筛选培养基，28℃培养3d。斜面培养：挑取平板培养基中蓝色圈较大的菌株接种至斜面培养基，28℃恒温，培养4d后置于4℃冰箱保存备用。摇床培养：接种斜面保存的菌种于发酵培养基，250mL摇瓶50mL装液量，28℃恒温，200r·min-1旋转摇床，培养2d。葡萄糖氧化酶第9页，共22页，2023年，2月20日，星期三实验材料药品：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、马铃薯、蔗糖、KNO3、K2HPO4、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O、可溶性淀粉、葡萄糖，(NH4)2HPO4、KH2PO4、CaCO3

、KI、脱氧胆酸钠、硫酸链霉素、(NH4)2SO4、K2HPO4、KCl、琼脂等各种培养基的组成成分、0.1％孟加拉红溶液，lmol/LHCl、lmol/LNaOH。高压蒸汽灭菌器、电热恒温干燥箱、紫外线杀菌灯、电炉、天平其它：酒精灯、试管、称量纸、牛角匙、烧杯、量筒、玻棒、pH试纸、玻璃珠、三角瓶、封口膜、无棉塞的空试管、培养皿、各种包装纸、防水纸、绳索、棉花、记号笔、标签等。准备无菌水，去离子水装于250ml三角瓶中，每瓶95ml，放置3-5颗玻璃珠，121℃灭菌30min。第10页，共22页，2023年，2月20日，星期三实验内容

（玻璃器皿的洗涤和包装）1．玻璃器皿的洗涤2．灭菌前玻璃器皿的包装(1)培养皿的包装(2)三角瓶的包装第11页，共22页，2023年，2月20日，星期三过滤除菌抗生素等不耐热物质需要进行过滤除菌。滤器和容器等一般需要进行高温灭菌。第12页，共22页，2023年，2月20日，星期三实验内容

（液体及固体培养基的配制过程）称量：按照配方正确称取各种原料（除琼脂外）放于有刻度的烧杯中。溶化：在烧杯中加入所需水量，玻棒搅拌，加热溶解。定容：倒入一量筒中，补水至所需体积。调pH值：滴加1mol/LNaOH或1mol/LHCl调至所需pH，用pH试纸对照。—液体培养基配制完成！加琼脂混匀：趁热加入1.5％的琼脂搅匀。——固体培养基配制完成！！第13页，共22页，2023年，2月20日，星期三如果培养基中某种药品用量太少，可以将其配制成较浓的溶液，然后按比例吸取一定体积溶液，加入至培养基中。固体培养基的配制：可以在配制好的液体培养基中加入适量的琼脂粉，灭菌。未冷却前取出，摇匀。第14页，共22页，2023年，2月20日，星期三肉膏蛋白胨培养基的配制1．培养基成分：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl0.5g，琼脂1.5～2g，水100ml。pH7.52．配制方法：（1）分别称取蛋白胨和NaCl的所需量，置于烧杯中，加入所需水量的2/3左右的蒸馏水。用玻棒挑取牛肉膏置于另一小烧杯中，进行称量。然后加入少量蒸馏水于小烧杯中溶解，（也可将小烧杯置于石棉网上适度加热溶解），倒入上述烧杯中，用玻棒搅拌使药品全部溶解。（2）加入所需量的琼脂（液体培养基省略此步骤）（3）用1mol/LNaOH溶液调pH至7.5。（4）将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。（5）分装、加塞、包扎。（6）高压蒸汽灭菌121℃灭菌20min。第15页，共22页，2023年，2月20日，星期三高氏合成一号培养基的配制1．培养基成分可溶性淀粉2g，KNO30.1g，K2HPO4·3H2O0.05g，MgSO4·7H2O0.05g，NaCl0.05g，FeSO4·7H2O0.001g，琼脂1.5～2g，水100ml，pH7.52．配制方法（1）称量及溶化量取所需水量的2/3左右加入到烧杯中，置于石棉网上加热至沸。称量可溶性淀粉，置于另一小烧杯中，加入少量冷水，将淀粉调成糊状，然后倒入上述装沸水的烧杯中，继续加热，使淀粉完全融化。分别称量KNO3、NaCl、K2HPO4和依次逐一加入水中溶解。（培养基使用前每100ml培养基加入灭菌的1ml5％MgSO4，1ml0.1％FeSO4溶液。）（2）加入所需量的琼脂（液体培养基省略此步骤）（3）用1mol/LNaOH溶液调pH至7.5。（4）将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。（5）分装、加塞、包扎。（6）高压蒸汽灭菌121℃灭菌20min。第16页，共22页，2023年，2月20日，星期三豆芽汁葡萄糖培养基的配制1．培养基成分黄豆芽10g葡萄糖5g琼脂1.5～2g水100ml自然pH2．配制方法（1）称新鲜黄豆芽10g，置于烧杯中，再加入100ml水，小火煮沸30min，用纱布过滤，补足失水，即制成10％豆芽汁。（2）配制时，按每100ml的10％豆芽汁加入5g葡萄糖，煮沸后加入琼脂（液体培养基省略此步骤），补足失水。（3）分装、加塞、包扎。（4）高压蒸汽灭菌110℃灭菌20min。第17页，共22页，2023年，2月20日，星期三马丁培养基的配制1．培养基成分

葡萄糖1g，蛋白胨0.5g，KH2PO4·3H2O0.1g，MgSO4·7H2O0.05g，0.1％孟加拉红溶液0.33ml，琼脂1.5～2g，水100ml，自然pH。2％去氧胆酸钠溶液2ml（预先灭菌，临用前加入）链霉素溶液（10,000u/ml）0.33ml（临用前加入）2．配制方法

（1）称量

称取培养基各成分的所需量。

（2）溶化在烧杯中加入约2/3所需水量，然后依次逐一溶化培养基各成分。按每100ml培养基加入0.33ml的0.1％孟加拉红溶液。

（3）加入所需琼脂（液体培养基省略此步骤），补足水至所需体积。

（4）分装、加塞、包扎。

（5）高压蒸汽灭菌110℃灭菌20min。

（6）临用前，加热融化培养基，候冷至60℃左右，按每100ml培养基无菌操作加入2ml的2％去氧胆酸钠溶液及0.33ml的链霉素溶液（10000u/ml），迅速混匀。第18页，共22页，2023年，2月20日，星期三实验内容

（棉塞的制作及试管、锥形瓶的包扎）棉塞的制作。试管包扎。锥形瓶用封口膜包扎。第19页，共22页，2023年，2月20日，星期三实验内容

（干热灭菌法）将培养皿、吸管等玻璃器皿洗净干燥后，用旧报纸包好，或装入特制的铁筒中(每个吸管用纸包好后装入铁筒)。包装吸管时应将吸取的一端放在取时先拆开的一端，防止取用时手触及吸取端。将包装好的玻璃仪器摆入电热烘箱中，彼此间留有一定的空隙以便流通空气。关紧箱门，打开电源。调节温度160℃～170℃，灭菌1小时。待自然降温冷却后(60℃以下)才能开门取出玻璃器皿，避免由于温度突然下降而引起玻璃器皿碎裂。第20页，共22页，2023年，2月20日，星期三实验内容（高压蒸汽灭菌法）高压蒸汽灭菌法是利用高压来提高蒸汽的温度，达到完全灭菌的目的。关好排水阀门放入去离子水至超过加热管2－3cm为止，注意水量一定要加足，否则容易造成事故。将要灭菌的培养基、灭菌水等，包装好后放入灭菌锅中，关上器盖，旋紧螺旋时，先将每个螺旋旋转到一定程度(不要太紧)，然后再旋紧相对的两个螺旋，以达到平衡旋紧，否则易造成漏气，达不到彻底灭菌的目的。通电加温，同时打开排气阀门，排尽锅内的空气，即阀门冲出的全部是蒸气时则表示彻底，此时可关闭排气阀门，如果过早关闭阀门，排气不彻底，也达不到彻底灭菌的目的。压力表的指针上升时，锅内温度也逐渐升高，当压力表指针升至15磅（0.1MPa）时，蒸气温度相当于120℃～121℃，此时开始计算灭菌时间，控制热源，使处于15磅压力保持20-30分钟，即能达到完全灭菌的目的，然后停止加温。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间（0.056MPa(112.6℃)灭菌30min）。灭菌时间一到，切断电源，待压力自然降至零、锅内蒸气完全排尽时，打开锅盖取出培养基，如需制备固体斜面培养基时，则应趁热将试管斜放在桌上，冷却后便可收起。最后将高压灭菌器内的剩余水排出。第21页，共22页，2023年，2月20日，星期三实验安排分为4类：1-2组制备细菌培养基（肉膏蛋白胨培养基）；(8*100ml)3-5组制备放线菌培养基（高氏合成1号