细菌检验技术

第一节细菌形态检验技术第一页，共92页。一、细菌染色标本镜检（一）染色标本检查的基本程序

1、涂片2、干燥3、固定4、染色染料种类：碱性染料、酸性染料、中性染料，碱性染料最常用

第二页，共92页。（1）单染法用一种染料进行染色，可观察细菌的大小、形态和排列，但不能用于鉴别细菌。如：亚甲蓝染色法（2）复染法用两种或两种以上的染料进行染色，不仅可以观察细菌的大小、形态和排列。还可用于鉴别细菌，又称为鉴别染色。鉴别染色—革兰染色抗酸染色第三页，共92页。

复染法的一般步骤

初染－→媒染－→脱色－→复染第四页，共92页。5、镜检显微镜：光学显微镜所用放大倍数：10×100＝1000所用镜头：油镜头镜油：香柏油或石蜡油香柏油折光率（n＝1.515）与玻片折光率（n＝1.52）接近显微镜使用完毕须擦拭镜头。第五页，共92页。（二）革兰染色法

1、染液组成：结晶紫染液、卢戈碘液、95％乙醇、稀释复红

第六页，共92页。2、染色方法标本涂片，固定结晶紫初染（1分钟）→碘液媒染（1分钟）→95%乙醇脱色（30秒）→复红复染（3-5分钟）→第七页，共92页。3、染色结果兰阳性菌（G+）——紫色；革兰阴性菌(G-)——红色。第八页，共92页。第九页，共92页。4、染色原理（1）渗透学说：与肽聚糖结构有关G﹢菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性屏障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。

Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，复红复染后呈红色。第十页，共92页。第十一页，共92页。（2）化学学说：与细菌细胞质中核糖核酸镁盐有关（3）等电点学说：与细菌所带电荷有关第十二页，共92页。5、临床意义鉴别细菌选择用药理解细菌的致病作用第十三页，共92页。6、影响因素（1）操作因素★涂片的厚薄★脱色时间的长短（2）染液因素★卢戈碘液放置时间过长★95％乙醇挥发★结晶紫与草酸铵混合时间太长（3）细菌因素：★细菌种类、★细菌菌龄第十四页，共92页。（三）抗酸染色法用于鉴别抗酸杆菌和非抗酸杆菌步骤：1、苯酚复红加温染色2、盐酸酒精脱色3、亚甲蓝复染结果：抗酸杆菌为红色非抗酸杆菌为蓝色第十五页，共92页。（四）其他染色法1、特殊结构染色法第十六页，共92页。2、负染色法第十七页，共92页。3、荧光染色第十八页，共92页。二、细菌不染色标本镜检应用：主要用于观察活菌的动力和运动方式常用方法：压滴法、悬滴法、暗视野映光法第十九页，共92页。压滴法载玻片细菌悬液盖玻片第二十页，共92页。悬滴法镜检第二十一页，共92页。3、暗视野聚光法4、相差显微镜检查法第二十二页，共92页。（二）影响因素1、操作因素2、玻片因素3、光线强度第二十三页，共92页。第二节细菌接种与培养技术第二十四页，共92页。一、基本条件（一）接种环与接种针用于取菌、接种及分离细菌的器具1、接种针用于挑去单个菌落、穿刺接种及斜面接种2、接种环用于划线分离培养、纯种接种、挑取菌落和菌液以及制备细菌涂片。3、接种前后都应对接种环和接种针进行灭菌第二十五页，共92页。（二）红外接种环灭菌器利用红外线产热进行灭菌第二十六页，共92页。（三）培养皿制备固体培养基常用的器皿，用于细菌的分离培养。第二十七页，共92页。附：微生物检验常用玻璃仪器的准备

1、玻璃器材的种类及用途2、玻璃器皿灭菌前的准备玻璃器皿在清洗、干燥后必须经正确的包裹和加塞后才能进行灭菌处理。第二十八页，共92页。

3、玻璃器材的清洗★新购置的玻璃器材：1％～2％盐酸浸泡－→清水清洗★用过的无污染器皿：洗涤剂洗刷－→清水清洗细菌污染的器材：消毒灭菌后再洗刷★盛培养基试管和平皿：高压灭菌－→趁热倒出－→洗涤剂洗刷－→清水冲洗★吸管：3％来苏浸泡－→清水冲洗★玻片和盖玻片：3％来苏和清洁液浸泡－→清水冲洗；染色后的玻片，应肥皂水煮沸10min再洗涤★含油脂的器皿：单独灭菌第二十九页，共92页。（四）培养箱1、电热恒温培养箱2、二氧化碳培养箱3、厌氧培养箱第三十页，共92页。（五）培养基培养基：是指人工配制的适合细菌生长繁殖的综合营养基质。1、培养基的成分及作用营养物质：肉浸液、牛肉膏、糖醇类、血液、鸡蛋和动物血清、生长因子、无机盐水凝固剂：琼脂、明胶抑制剂指示剂第三十一页，共92页。2、培养基的种类（1）按培养基的物理性状分类液体培养基：不含凝固剂，用于增菌和接种纯种细菌。半固体培养基：含0.3％～0.5％琼脂，用于观察细菌的动力。固体培养基：含2％～2.5％琼脂，多用于细菌的分离培养。第三十二页，共92页。（2）按培养基的用途分类基础培养基：培养营养要求不高的细菌，如普通平板营养培养基：能满足营养需求较高细菌的生长，如血平板鉴别培养基：含有某些特定的底物，用于鉴别细菌，如克氏双糖培养基（KIA）选择培养基：具有选择性抑制作用，用于选择性的培养目的菌，如SS平板增菌培养基：促进目的菌的生长，适用于含菌量较少的标本，如葡萄糖肉汤。厌氧培养基：用于培养厌氧菌第三十三页，共92页。3、培养基制备的一般程序调配溶化矫正pH过滤澄清分装灭菌检定培养基灭菌★基础培养基：121℃高压蒸汽灭菌15分钟★含糖培养基：113℃灭菌15分钟★鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌3天3次★不耐高温的液体成分：滤过除菌保存第三十四页，共92页。二、细菌接种与培养技术（一）无菌技术1、细菌检验的操作需在无菌室或超净工作台内进行。2、无菌室、超净工作台使用前后需进行消毒。3、细菌检验使用的物品使用前后需严格灭菌4、无菌试管、烧瓶、吸管的使用5、标本的采集6、废弃物的处理8、个人防护第三十五页，共92页。（二）细菌接种与分离技术

1、细菌接种的基本程序灭菌接种环沾取标本接种灭菌接种环杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境第三十六页，共92页。2、细菌接种法（1）平板划线接种法：

目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。

方法：1）分区划线法：适用于含菌量较多的标本2）连续划线法：适用于含菌量较少的标本第三十七页，共92页。分区划线法第一区划线灭菌接种环第二区划线灭菌接种环第三区划线灭菌接种环第三十八页，共92页。连续划线法第三十九页，共92页。（2）液体培养基接种法（3）穿刺接种法:用于观察细菌动力（4）斜面接种法（5）倾注培养法:用于细菌计数（6）涂布接种法：见于药敏试验第四十页，共92页。（三）细菌的培养方法一般培养（需氧培养）：★培养温度：35℃（采用恒温培养箱）★培养时间：18～24h二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳培养箱、化学法厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等第四十一页，共92页。三、细菌的生长现象

（一）细菌在液体培养基中的生长现象混浊沉淀：多见于链状排列的细菌菌膜：多见于厌氧菌第四十二页，共92页。细菌在液体培养基中的生长现象第四十三页，共92页。（二）细菌在半固体培养基中的生长现象有鞭毛细菌：在培养基中沿穿刺线并向外扩散生长，穿刺线边缘模糊。无鞭毛细菌：只沿穿刺线生长，穿刺线边缘清晰。第四十四页，共92页。细菌在半固体培养基中的生长现象有动力现象无动力现象第四十五页，共92页。（三）细菌在固体培养基中的生长现象菌落★定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形成单一肉眼可见的细菌集团。★菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性★菌落类型：光滑型（S）、粗糙型（R）、黏液型（M）菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。第四十六页，共92页。菌落第四十七页，共92页。菌落与菌苔第四十八页，共92页。第三节细菌生化鉴定技术第四十九页，共92页。

细菌的生化反应：细菌具有各自独特的酶系统，因而在代谢过程中对底物的分解能力不同，所产生的代谢产物也不同，这些代谢产物各具有不同的生物化学特点，利用生物化学的方法来检验这些代谢产物，可用于鉴别和鉴定细菌，这种用生化反应测定方法称为细菌的生化反应。第五十页，共92页。一、碳水化合物的代谢试验糖发酵试验葡萄糖氧化／发酵试验（O/F试验）甲基红试验V-P试验七叶苷水解试验Β－半乳糖苷渗透酶试验第五十一页，共92页。（一）糖发酵试验原理：不同细菌可分解不同的糖多糖－→单糖－→丙酮酸－→酸性产物(或产酸产气)－→pH↓－→指示剂呈酸性变色(若产气者有气泡出现)培养基：糖发酵管、半固体发酵管、微量发酵管试剂：酚红、溴甲酚紫等结果:培养基呈酸性变色（红黄）应用：观察细菌对糖的分解情况，常用于肠道杆菌的鉴定第五十二页，共92页。糖发酵试验结果判断反应现象结果描述酸性变色、有气泡分解××糖产酸、产气酸性变色、无气泡分解××糖产酸、不产气培养基不变色不分解××糖第五十三页，共92页。糖发酵试验第五十四页，共92页。（二）葡萄糖氧化/发酵试验1、原理：细菌分解葡萄糖的过程中对氧的需求不同，分为氧化、发酵和产碱三型单糖－→丙酮酸－→酸性产物－→pH↓－→指示剂呈酸性变色2、培养基：HL葡萄糖培养基3、试剂：石蜡

4、结果：两管均不变色：产碱型石蜡管变色：发酵型非石蜡管变色：氧化型5、应用：肠杆菌和非发酵菌的鉴别第五十五页，共92页。（三）甲基红试验原理：细菌分解糖，产生丙酮酸，进一步生成大量混合酸，使培养基pH维持在4.4以下，加入甲基红（4.4-5.4）后，使甲基红呈现红色反应。此为甲基红试验阳性。培养基：葡萄糖蛋白胨水试剂：甲基红试剂结果：加入试剂后，培养基呈现红色：+培养基不变色：－应用：是肠道杆菌常用的生化反应试验，主要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌第五十六页，共92页。葡萄糖丙酮酸大量混合酸pH降至4.4以下甲基红试剂培养基变红甲基红试验第五十七页，共92页。甲基红试验第五十八页，共92页。（四）伏－普试验（V-P试验）原理：细菌发酵葡萄糖，产生丙酮酸，丙酮酸脱羧生成乙酰甲基甲醇，在碱性环境中乙酰甲基甲醇被氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的精氨酸所含的胍基结合，生成红色化合物。培养基：葡萄糖蛋白胨水结果：加入试剂后，培养基呈现红色：+培养基不变色：－应用：是肠道杆菌常用的生化反应试验，主要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌第五十九页，共92页。葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇二乙酰V-P试剂培养基变红V－P试验脱酸第六十页，共92页。葡萄糖发酵形成丙酮酸后的不同代谢途径葡萄糖丙酮酸大量混合酸pH降至4.4以下甲基红试剂培养基变红乙酰甲基甲醇二乙酰V-P试剂培养基变红脱酸第六十一页，共92页。（五）B-半乳糖苷酶试验1、原理：有些细菌产生的B-半乳糖苷酶可分解邻硝基酚B-半乳糖苷（ONPG）产生邻硝基苯酚（黄色）2、培养基：1%乳糖肉汤琼脂3、试剂：甲苯、ONPG4、结果：加入ONPG后，菌悬液黄色：+菌悬液无色：-5、应用：迟缓发酵乳糖细菌的快速检测第六十二页，共92页。（六）七叶苷水解试验1、原理：某些细菌可以分解七叶苷七叶苷葡萄糖+七叶素黑色沉淀2、培养基：七叶苷培养基3、结果：培养基黑色：+培养基不变色：-4、应用：D群链球菌和其他链球菌的鉴别Fe2+第六十三页，共92页。二、蛋白质类代谢试验靛基质试验硫化氢试验尿素酶试验苯丙氨酸脱氨试验氨基酸脱羧酶试验第六十四页，共92页。（一）靛基质试验原理：细菌产生色氨酸酶，可分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚），靛基质与试剂对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰靛基质。培养基：蛋白胨水试剂：靛基质试剂（含对二甲基氨基苯甲醛）结果：加入试剂后，培养基出现红色液面：+培养基液面为黄色：－应用：用于肠道杆菌的鉴定第六十五页，共92页。靛基质试验原理色氨酸酶色氨酸靛基质（吲哚）

玫瑰靛基质（玫瑰吲哚）对二甲基氨基苯甲醛第六十六页，共92页。靛基质试验第六十七页，共92页。（二）硫化氢试验原理：细菌分解蛋白质中的含硫氨基酸，生成硫化氢，硫化氢与培养基中的铁盐或铅盐结合生成黑色络合物。培养基：含硫酸亚铁或醋酸铅的培养基结果：培养基变黑：阳性不变黑：阴性应用：常用于肠道杆菌的鉴定第六十八页，共92页。第六十九页，共92页。（三）尿素酶试验原理：产生脲酶的细菌，能水解尿素生成氨和CO2，氨使培养基呈碱性变色。培养基：尿素培养基试剂：酚红指示剂结果：培养基变红：+培养基不变色－应用：肠杆菌科属间鉴定第七十页，共92页。尿素酶试验原理尿素尿素酶氨+CO2培养基pH升高酚红呈碱性变色（红）第七十一页，共92页。(四)苯丙氨酸脱氨实验原理：细菌的具有的苯丙氨酸脱氨酶，可使培养基中的苯丙氨酸脱氨，形成苯丙酮酸，后者与三氯化铁作用，形成绿色化合物。培养基：苯丙氨酸琼脂试剂：10％三氯化铁结果：加入试剂后培养基呈现绿色为阳性应用：多用于肠道杆菌的鉴定第七十二页，共92页。苯丙氨酸脱氨试验原理苯丙氨酸苯丙氨酸脱氨酶苯丙酮酸10％三氯化铁绿色化合物第七十三页，共92页。（五）氨基酸脱羧酶试验1、原理：某些细菌可产生氨基酸脱羧酶，可使氨基酸脱羧成胺和二氧化碳，胺溶于水使培养基显碱性2、培养基：氨基酸脱羧酶培养基（糖、氨基酸）3、指示剂：为溴甲酚紫5.2（黄）-6.8（紫）4、结果：培养基变紫色：+培养基为黄色：-5、应用：肠杆菌科细菌的鉴别第七十四页，共92页。三、碳源利用试验

（一）枸橼酸盐利用试验原理：某些细菌能力利用培养基中的枸橼酸盐作为唯一的碳源，也能利用其中的铵盐作为唯一氮源，细菌生长过程中分解枸橼酸盐产生碳酸盐和分解铵盐生成的氨，使培养基变碱，是指示剂呈碱性反应。培养基：枸盐酸盐培养基（淡绿色）试剂：溴麝香草酚蓝（pH6.0以下呈黄色，pH7.6以上呈蓝色）结果：培养基变蓝：+培养基不变色：－应用：肠杆菌科属间鉴别第七十五页，共92页。枸橼酸盐利用试验原理枸橼酸盐铵盐碳酸盐氨培养基pH升高溴麝香草酚蓝呈碱性变色培养基变蓝培养基第七十六页，共92页。（二）丙二酸盐利用试验1、原理：某些细菌可利用丙二酸为唯一碳源，分解丙二酸为碳酸钠，碳酸根水解是培养基显碱性2、培养基：丙二酸钠培养基3、指示剂：溴麝香草酚蓝（pH6.0以下呈黄色，pH7.6以上呈蓝色）4、结果：培养基变蓝色：+培养基不变色：-5、应用：肠杆菌科细菌属之间的鉴别第七十七页，共92页。四、酶类试验（一）触酶（过氧化氢酶）试验1、原理：有的细菌有触酶，能催化过氧化氢生成水和氧，氧分子，出现气泡。2、方法：取细菌少许，滴加3%Ｈ２Ｏ２试剂１－２滴。３、结果：一分钟内产生大量气泡：＋一分钟内不出现气泡：－４、应用：用于革兰阳性球菌的初步分类第七十八页，共92页。（二）氧化酶（细胞色素氧化酶）试验１、原理：某些细菌的氧化酶，可以将二甲基对苯二胺或四甲基对苯二胺氧化生成红色醌类化合物２、用洁净滤纸条粘取被检细菌菌落，或直接将试剂直接滴在被检细菌菌落上３、结果：出现红色：＋不出现红色：－４、应用：用于肠道杆菌科和假单胞菌的鉴别。第七十九页，共92页。（三）凝固酶试验１、原理：金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆中纤维蛋白原转变为不溶性的纤维蛋白。２、方法：（１）玻片法：用于结合凝固酶试验用未稀释的兔血浆和生理盐水各滴载玻片两端。挑少许分别与之混合。（２）试管法：用于游离凝固酶试验取三支洁净试管，其中一支加入０.５ｍｌ１:４稀释兔血浆，其余两支分别加入阴阳性对照，各加入０.５ｍｌ待检菌。

第八十页，共92页。３、结果：出现凝集：＋不出现凝集：－４、应用：主要用于葡萄球菌的鉴定第八十一页，共92页。（四）ＤＮＡ酶试验１、原理：某些细菌能产生ＤＮＡ酶，能分解ＤＮＡ，使长链ＤＮＡ变成寡链ＤＮＡ长链可被酸沉淀，寡链ＤＮＡ可溶于酸。２、培养基：DNA琼脂平板3、方法：将细菌接种在DNA平板，培养后HCl覆盖平板4、结果：菌落周围出现透明圈：+菌落周围无变化：-5、应用：用于葡萄球菌、沙雷菌和变形杆菌的鉴定。第八十二页，共92页。（五）硝酸盐还原试验1、原理：2、培养基：硝酸盐培养基3、结果：试剂出现红色：+试剂不出现红色：-4、应用：用于肠杆菌科细菌、假单胞菌和厌氧菌的鉴别。硝酸盐亚硝酸盐亚硝酸重氮磺酸细菌醋酸对氨基苯磺酸N-a萘胺偶氮苯磺酸（红色）a-萘胺第八十三页，共92页。五、其他试验（一）复合生化试验1、克氏双糖铁（KIA）试验（1）原理：KIA中含有牛肉膏、酵母浸膏、蛋白胨、乳糖、葡萄糖、枸橼酸胺铁、酚磺酞指示剂。乳糖是葡萄糖的十倍。1）若细菌只分解葡萄糖，只能产生少量的酸，在培养8-11小时内，分解葡萄糖的产生的酸可使培养基底层和斜面变黄色，18-24小时后，斜面所含氨基酸发生降解，中和斜面的酸，是斜面变红色（碱色），底层仍为黄色（酸色）第八十四页，共92页。2）若细菌能分解乳糖，则可以中和斜面的碱，使整个培养基呈黄色。3）若细菌能分解含硫氨基酸，产生H2S，H2S与枸橼酸铵铁反应，产生黑色沉淀。（2）结果：斜面碱性/底层碱性：不发酵糖类斜面碱性/底层酸性：发酵葡萄糖斜面碱性/底