变性蛋白的复性和基因工程药物的质量控制

变性蛋白的复性和基因工程药物的质量控制第1页，共25页，2023年，2月20日，星期三一、蛋白质变性由于外界因素的作用，使天然蛋白质分子的构象发生了异常变化，从而导致生物活性的丧失以及物理、化学性质的异常变化，这种现象称为蛋白质的变性(denaturation)。变性可以涉及次级键、二硫键的断裂但不涉及一级结构上肽键的断裂第2页，共25页，2023年，2月20日，星期三二、蛋白质复性的意义→目标蛋白质没有生物活性(包涵体)→分离回收包涵体，→溶解包涵体(目标蛋白质恢复应有的天然构象和活性)

第3页，共25页，2023年，2月20日，星期三三、变性蛋白质的复性

就是脱除变性剂使溶解的包涵体蛋白质的伸展肽链折叠成正确的空间结构。

包涵体形成的原因——主要是高水平表达的结果。在高水平表达时，新生肽链的聚集速率超过蛋白的正确折叠的速率就会导致包涵体的形成。重组蛋白在大肠杆菌中表达时，缺乏一些蛋白折叠过程中需要的酶和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等。第4页，共25页，2023年，2月20日，星期三包涵体的分离和溶解

1、包涵体的分离收集重组菌，破碎细胞；离心除上清；使用低浓度的变性剂洗涤沉淀。2、包涵体的溶解打断包涵体蛋白分子内和分子间的各种化学键，使多肽链伸展。一般用强的变性剂，如脲、盐酸胍或硫氰酸盐，SDS，各种溶解方法都各有利弊。第5页，共25页，2023年，2月20日，星期三蛋白复性方法第6页，共25页，2023年，2月20日，星期三1、稀释、透析复性法蛋白质复性的最大问题，是在复性过程中形成中间体和多聚体，中间体阻碍作用大的使蛋白质正确折叠困难，复性就困难；阻碍小或无阻碍的容易复性。降低蛋白浓度可以减少中间体形成提高复性率。所以，在复性前用使用稀释、透析、过滤及凝胶过滤除去变性剂、还原剂，降低蛋白浓度。第7页，共25页，2023年，2月20日，星期三2、含有二硫键的蛋白的复性

复性时涉及正确二硫键（分子内或者分子间）的重建。①空气氧化法②加入氧化剂-还原转换试剂③加入氧化型谷胱甘肽④使用还原剂保护巯基⑤加入二硫苏糖醇。第8页，共25页，2023年，2月20日，星期三3、封闭蛋白的疏水簇促进复性

对蛋白质结构和序列的分析，确定出在蛋白中可能引起分子间相互作用的疏水簇，破坏这种疏水簇的突变，可能会减少聚集。用特异性结合疏水簇的单克隆抗体来封闭疏水簇，减少分子间结合引起的聚集。第9页，共25页，2023年，2月20日，星期三4、凝胶过滤层析复性

层析介质的隔离作用，降低了蛋白之间相互作用产生的聚集，使复性浓度、复性率得到很大的提高。5、小分子添加剂促进复性6、分子伴侣或折叠酶促进的复性7、人工分子伴侣促进的复性第10页，共25页，2023年，2月20日，星期三

色谱法复性过程的示意图第11页，共25页，2023年，2月20日，星期三基因工程药物的质量控制

第12页，共25页，2023年，2月20日，星期三一、基因工程药物与一般药物的对比1、基因工程药物是利用活细胞作为表达系统，产物的分子量较大，并有复杂的结构。2、许多基因工程药物是参与人体一些生理功能精密调节所必需的蛋白质。3、宿主细胞中表达的外源基因，在转录或翻译、工艺放大等过程中，都有可能发生变化。第13页，共25页，2023年，2月20日，星期三二、基因工程药物的质控要点原材料的控制生产的控制最终产品的质量控制产品的保存第14页，共25页，2023年，2月20日，星期三（一）生物材料的质量控制⒈表达载体和宿主细胞明确目的基因的来源、克隆经过，表达载体的构建、结构和遗传特性⒉克隆基因的序列提供插入基因和表达载体两端控制区的核苷酸序列。所有与表达有关的序列应详细叙述⒊表达详细叙述生产过程中，启动和控制克隆基因在宿主细胞中的表达所采用的方法及表达水平第15页，共25页，2023年，2月20日，星期三（二）生产的控制1、培养过程的质量控制a、原始细胞库应详细记述种子材料的来源、方式、保存及预计使用寿命。应提供在保存和复苏条件下宿主载体表达系统的稳定性证据。采用新的种子批时，应重新做全面检定。第16页，共25页，2023年，2月20日，星期三b、有限代次的生产提供培养生产浓度与产量恒定性、培养和诱导基因产物的数据，依据宿主细胞-载体系统的稳定特性，确定最高允许传种代数和细胞倍增数。c、连续培养生产应提供长期培养后表达基因的分子完整性资料，以及宿主细胞的表型和基因型特征。

第17页，共25页，2023年，2月20日，星期三2、纯化过程的质量控制

产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子批间保持一致性；外源蛋白质、DNA与热源质控制在规定限度以下。在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、核酸、糖类、病毒、培养基成分及精制工序本身引入的化学物质，并有检测方法。第18页，共25页，2023年，2月20日，星期三（三）目标产品的质量控制基因工程药物的质量控制主要包括以下几项要求：产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。第19页，共25页，2023年，2月20日，星期三1.理化性质鉴定肽图分析：根据蛋白质、多肽的分子量大小以及氨基酸的组成特点，使用专一性较强的蛋白水解酶作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片段，通过一定的分离检测手段形成特征性指纹图谱。常用方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效液相色谱和毛细管电泳氨基酸成分分析：应包括甲硫氨酸、半胱氨酸及色氨酸的准确值。部分氨基酸序列分析：氨基端15个氨基酸。重组蛋白质的浓度测定：凯氏定氮法、双缩脲法、染料结合比色法、福林-酚法和紫外光谱法。相对分子量测定：凝胶过滤法和聚丙烯酰胺凝胶电泳。第20页，共25页，2023年，2月20日，星期三2、纯度分析a、目的蛋白质含量测定根据蛋白质理化性质等来设计常用方法有：聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效液相色谱。第21页，共25页，2023年，2月20日，星期三b、产物杂质检测包括蛋白质和非蛋白质杂质。蛋白类：宿主细胞蛋白，采用免疫方法和电泳相结合；非蛋白类：病毒、细菌等微生物、热源质、内毒素、致敏原及DNA。利用微生物学方法检测无菌。热源质检测用家兔注射。第22页，共25页，2023年，2月20日，星期三3、生物活性测定

保证基因工程药物产品有效性的重要手段，需要进行动物体内试验和通过细胞培养进行体外效价测定。第23页，共25页，2023年，2月20日，星期三4、稳定性考察是评价药品有效性和