原位杂交组织化学技术

原位杂交组织化学技术第1页，共108页，2023年，2月20日，星期三第2页，共108页，2023年，2月20日，星期三核酸杂交

菌落原位杂交斑点杂交法固相杂交

Southern印迹杂交

Northern印迹杂交组织原位杂交

吸附杂交、液相杂交发光液相杂交、液相夹心杂交

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原位杂交属于固相核酸分子杂交的范畴，但它区别于固相核酸分子杂交中的任何一种核酸分子杂交技术：菌落杂交系细菌裂解释放出DNA，然后进行杂交；斑点杂交是检测特定的DNA片段；Southern印迹杂交法是以鉴定DNA中某一特定的基因片段；Norhtern印迹杂交法是用以检测某一特定RNA片段；第4页，共108页，2023年，2月20日，星期三分子杂交技术分子生物学中用于检测生物样本中是否含有特定的生物分子的一门技术。样品制备电泳杂交转膜结果显示探针制备分子杂交原理及流程图第5页，共108页，2023年，2月20日，星期三原位杂交组织化学技术(insituhybridizationhistochemistry；ISHH)简称原位杂交,是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。

第6页，共108页，2023年，2月20日，星期三第7页，共108页，2023年，2月20日，星期三第8页，共108页，2023年，2月20日，星期三

核酸分子杂交除了能在变性的单链DNA间进行外，在DNA与RNA间、RNA与RNA间，以及寡核苷酸与DNA或RNA间也可通过碱基配对(A-T、、C—G、A—U)实现分子杂交。因此，核酸分子杂交所用的探针种类可以是DNA、RNA或寡核苷酸。探针的标记物常用的有放射性核素和非放射性核素性化学物质两大类。其作用在于杂交后辅以感光或化学反应，显示与探针互补的靶核酸(DNA或RNA)第9页，共108页，2023年，2月20日，星期三DNA-DNA杂交双链分子变性复性第10页，共108页，2023年，2月20日，星期三第11页，共108页，2023年，2月20日，星期三

应先将双链DNA分子通过变性解聚成单链后再进行杂交。单链核酸分子则不需变性即可直接进行杂交。杂交双链即杂交体的稳定程度与它的变性或熔解温度（Tm）有关，Tm值越高，杂交体越稳定。影响杂交体Tm值的因素主要包括以下几个方面：第12页，共108页，2023年，2月20日，星期三（1）杂交双链的碱基组成：G－C之间有三个氢键，A－T之间或A－U之间有两个氢键，故（G＋C）含量越高的杂交双链Tm值越高。（2）杂交双链的长度：杂交双链越长，Tm值越高。（3）杂交双链的碱基错配程度：错配的碱基越多，即错配的程度越高，Tm值越低。（4）溶液中的离子强度：离子强度越高，Tm值越高（5）变性剂（如甲酰胺）的浓度：甲酰胺，以降低杂交反应的温度。第13页，共108页，2023年，2月20日，星期三

一、

核酸探针核酸探针是指已知碱基序列的核酸片段，并与待测组织的核酸片段特异性结合（碱基互补）。一）核酸探针的种类根据核酸性质的不同，核酸探针可分为DNA探针、cDNA探针、RNA探针、cRNA探针及寡核苷酸探针等几类。DNA探针和cDNA还有单链和双链之分。其中用于组织细胞内DNA或RNA定位检测的探针主要有单链cDNA探针、cRNA探针和寡核苷酸探针。第14页，共108页，2023年，2月20日，星期三（一）cDNA探针

cDNA是互补于mRNA的DNA分子。通过选择不同的载体来控制所产生的cDNA是双链还是单链。如果以质粒作载体，则产生双链cDNA，获得的探针也是双链

双链cDNA探针的检测灵敏度较低，较少用来做探测细胞内mRNA的原位杂交反应。第15页，共108页，2023年，2月20日，星期三

如果将cDNA导入M13衍生载体中，则可产生大量的单链cDNA。用这种单链cDNA作探针,从而提高了杂交反应敏感性。（二）

cRNA探针

cRNA探针是以DNA为模板在体外转录而成的探针。以cRNA探针进行杂交反应可避免应用双链cDNA探针作杂交反应时存在的两条链之间的复性问题。第16页，共108页，2023年，2月20日，星期三

cRNA和mRNA之间形成的杂交体要比cDNA－mRNA杂交体稳定，因为杂交反应后可经受高严格度洗涤。cRNA－mRNA杂交体不受RNA酶的影响，故杂交后还可用RNA酶处理，以除去未结合的探针。此外，用体外转录合成的cRNA探针的长度比较一致。第17页，共108页，2023年，2月20日，星期三

cRNA探针的制备过程较复杂，需要较高的分子生物学实验条件，cRNA对RNA酶敏感，易被RNA酶破坏，因而在操作过程中需要严格防止RNA酶污染。第18页，共108页，2023年，2月20日，星期三（三）寡核苷酸探针

寡核苷酸探针是指化学合成技术在体外合成的，一般含10~50个核苷酸的探针。寡核苷酸探针目前均由DNA合成仪合成。

在设计筛选寡核苷酸探针时应遵守以下一些原则：

（1）长度一般为18~50个核苷酸，过长者，杂交时间较长，合成量低，过短者，特异性较差。第19页，共108页，2023年，2月20日，星期三（2）碱基中（G＋C）含量应在40％~60％范围以内，超出此范围则会增加非特异性杂交。（3）探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探针杂交的“发夹”状结构。（4）避免单一碱基重复出现过多，不能多于4个，如不能出现－CCCCC－。第20页，共108页，2023年，2月20日，星期三

寡核苷酸探针也有一定缺点，如与mRNA的杂交不如RNA－RNA杂交稳定，再则，因其分子较短，结合的标记物较少，故其敏感性较低。第21页，共108页，2023年，2月20日，星期三二）核酸探针标记的基本原理

利用核酸探针来检测相应的核酸，必须对探针进行标记，理想的探针标记物应具备以下几个条件：首先，标记后的探针分子结构要尽可能与原来的分子结构相同；第二，标记探针的显示或检测要简便、节时、准确、可靠、重复性好；第22页，共108页，2023年，2月20日，星期三

第三，应安全无害。目前用于标记原位杂交探针的标记物有20多种，可分为放射性标记物（同位素）和非放射性标记物。常用的同位素有32P、35S。

第23页，共108页，2023年，2月20日，星期三第24页，共108页，2023年，2月20日，星期三第25页，共108页，2023年，2月20日，星期三第26页，共108页，2023年，2月20日，星期三第27页，共108页，2023年，2月20日，星期三第28页，共108页，2023年，2月20日，星期三三、原位杂交组织化学基本技术由于核酸探针的种类和标记物的不同，在具体应用的技术方法上也各有差异，但其基本方法和应用原则大致相同。大致可分为：①杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等；②杂交；③杂交后处理；④显示：包括放射性自显影和非放射性标记的显色。第29页，共108页，2023年，2月20日，星期三1.组织和细胞标本的准备原位杂交技术可应用于冷冻或石蜡片、细胞培养片或细胞切片等。为了获得良好的杂交结果，组织和细胞标本的取材和处理是十分重要的，总的目的是既要充分保留被测核酸不被降解，又要尽可能维持原有组织或细胞的形态结构。其基本要求与免疫组织化学技术相似，即新鲜取材和及时固定第30页，共108页，2023年，2月20日，星期三

DNA的稳定性较好，一般不需特殊处理。常规的石蜡或冷冻切片均适用于组织或细胞内DNA的原位杂交检测，即使长期保存的石蜡块也可用于回顾性研究。

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但RNA非常容易降解．RNA酶在周围环境中几乎无处不在，而且一般的消毒方法不能将其灭活。防止RNA酶污染及灭活RNA酶的方法有；第32页，共108页，2023年，2月20日，星期三①标本尽早固定，组织固定剂可以灭活组织内的RNA酶；②所用玻璃器皿均需经180℃处理3h以上，或用新鲜配制的0.1%二乙基焦碳酸盐(DEPC)水在室温中处理2—3h；③所用试剂要用DEPC水配制并经高压消毒；④所有操作都要带手套；⑤各种反应过程中注意应用RNA酶抑制剂。只要充分注意以上各点，在石蜡切片上一样可以得到良好的RNA杂交结果，而石蜡切片的组织形态较冷冻切片好得多。第33页，共108页，2023年，2月20日，星期三

用于杂交的组织或细胞标本的固定剂与免疫组化相似，其中醛类固定剂应用最多，尤其是用4％多聚甲醛(用0.1mol/LPB配制)固定可以较好地保存组织中的靶核酸，组织形态结构的保存也优于沉淀类固定剂(如乙醇)，而且同时也适用于免疫组化染色。固定时，有两点需注意，一是尽量早期固定，另一是固定时间不能太长，最好采用4℃下固定，一般不超过24h(根据组织片的厚薄从30min至24h)。第34页，共108页，2023年，2月20日，星期三2.杂交前处理杂交前处理是指从石蜡切片脱蜡到预杂交前的一系列过程。其主要目的是：①增强组织或细胞的通透性，以利于探针的穿透；②尽可能减少与探针产生非特异吸附的背景。采用的方法有：第35页，共108页，2023年，2月20日，星期三

2.1.蛋自酶消化酶消化的应用不仅可以消除组织固定时产生的分子间交联对靶核酸造成的屏蔽作用，还有增加组织通透性和去除无关的杂蛋白的意义。蛋白酶消化对石蜡切片原位杂交结果的好坏具有非常重要的影响。常用的有蛋白酶K(proteinas。K)，此外还有胃蛋白酶(pepsin)、链霉蛋白酶(pronase)等。第36页，共108页，2023年，2月20日，星期三

各种酶的最佳作用通常要求37℃．且与反应溶液的pH值相关，如蛋白酶K和链霉蛋白酶在中性pH值下才能发挥最大的酶活力，而胃蛋自酶最大活力是在PH1.8—2.5之间，但是，消化酶的浓度、作用时间等参数的选择则应根据组织的类型、固定购程度，探针的大小、酶的批号和活性等作具体分析，经过多次预实验才能选定最佳方案。消化后剩余的酶活性常用甘氨酸浸泡或4％多聚甲醛后固定等方法来中止。当然，所用的消化酶本身不能含有核酸水解酶的活性.第37页，共108页，2023年，2月20日，星期三

2.2稀酸处理稀酸处理常用的是0.2mol/LHCl；其目的是使碱性蛋白变性，消除其对杂交反应的干扰，有利于靶核酸的暴露，减少背景。在蛋白酶消化后的稀酸处理还具有清除蛋白酶的作用。此外，如果杂文后所用抗体采用辣根过氧化物酶等标记的话．稀酸还有去内源性酶活性的作用。第38页，共108页，2023年，2月20日，星期三

2.3乙酰化组织细胞中的碱性蛋白带有正电荷，可以与探针中的磷酸根和标记物所带酌负电荷产生静电吸附。乙酞化的目的在于中和标本中的正电荷，减少静电吸附，从而减低背景着色。常用的方法是在杂交前用0.25％乙酸酐或无水乙酸(溶于0.1mol/L三乙醇胺，pH8)处理切片：第39页，共108页，2023年，2月20日，星期三

2.4去垢剂有些实验在杂交前还加用去垢剂处理切片或在其他溶液中加入去垢剂，以溶解细胞的膜蛋白，增强探针的通透性。常用的去垢剂是0.01％一0.3％的TritonX—100。类似的增强通透性的措施还有反复冻融、用乙醇和二甲苯等溶剂处理切片等。第40页，共108页，2023年，2月20日，星期三

3.杂交杂交即指序列互补的探针与靶核酸间的配对结合。这是原位杂交技术的关键步骤：双链的探针杂交前要事先解链(变性)，若探针和靶核酸均为DNA则可将探针墒加在标本上后一起变性。常规的变性方法是用高温处理切片(90一100℃，5—10min)，也可用酸(Hcl)或碱(NaOH)处理。

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理论上解离的核酸互补链，重新形成碱基配对的螺旋结构的复性(杂交)速度取决于：反应温度；正离子浓度；DNA浓度；DNA片段大小。由于杂交是两条单链间的随机结合，双链DNA探针和DNA靶核酸变性后的复性过程中也可能发生探针和靶核酸自身两条链的重新结合，此外，探针还可能与组织内碱基顺序相似的核酸以及其他无关结构非特异结合(吸附)。第42页，共108页，2023年，2月20日，星期三

因此，欲达到最佳的信号——背景着色比，应选择适当的杂交条件(杂交的温度、杂交液的离子强度和PH值)；要注意探针种类和大小，提高杂交时探针的浓度；在杂交液中加入—些类似于免疫组化中的封闭物质i在杂交前先滴加不合探针的杂交液对组织片进行预处理。第43页，共108页，2023年，2月20日，星期三第44页，共108页，2023年，2月20日，星期三3.2．杂交温度复性反应均需在一定的温度下进行，以破坏和弱化链内的二级结构。温度高杂交反应快．温度太高则可破坏组织形态，一股应采用低于该DNATm(Tm为DNA分子50％解链时的湿度)25℃的温度。需注意，核酸链中G-C多者Tm高(G—C占50%时Tm约为70℃)。杂交液中甲酰胺可降低杂交温度，每增加1％甲酰胺，可下降0.35一0.65℃．反应的常用条件是：50％中酰胺，42-65℃，杂交16-20h.第45页，共108页，2023年，2月20日，星期三3.3．杂交液中高子强度和pH

单价阳离了可以减少两条互补链的磷酸基团的负电荷排斥力，因此在一定范围内，较高的离子浓度可以增强杂交体的稳定性。而两价阳离于可使双链DNA结合更牢固，因此存变性和杂交时应加入EDTA去除双价离子。杂交常用的PH值在6．5—7．5之间。第46页，共108页，2023年，2月20日，星期三3.4．探针的浓度杂交速率还与探针的长度、复杂性及浓度有关。一般说来，较长的探针杂交较快，但太长时在组织内穿远性差，结果反而不好。复杂性高的探针杂交所需时间较长。核酸杂交反应服从于二级反应动力学，待测核酸的浓度决定分子间的碰撞频率，可以影响杂交反应的速度，探针浓度高亦可缩短杂交时间。因此，在杂交液中加入大分子非离子性多聚体，如葡萄糖硫酸盐、聚丙烯酸和聚乙二醇等可以增加杂交液中探针的相对浓度，而加快杂交的进行。杂交常用的探针浓度为0.5—5.0ug／m1第47页，共108页，2023年，2月20日，星期三信/噪“噪音”（noise）是固相膜杂交方法常遇到的问题，指标记DNA结合到空白膜上的放射性计数，即本底。这个问题的克服一是使用高纯度的核酸制品和充分严格的杂交条件，二是选择合格的杂交反应液和对膜进行处理。研究发现，随着离子强度的增加，空白膜（未固定DNA对照膜）上的“噪音”水平增加，而在50%甲酰胺-6×SSC的杂交反应液中“噪音”最低。

第48页，共108页，2023年，2月20日，星期三3.5．杂交液的构成基于以上原理，杂交液内除了探针外，还含有适量的甲酰胺，并保持一定的离子强度和pH值。此外，还应含有一些封闭物质，如葡聚搪、聚乙烯吡咯烷酮(PvP)、牛血清白蛋白(BsA)、tRNA或鱼精DNA等，以阻止探针与组织内的一些成分发生非特异性结合。为了提高杂交的特异性．在杂交反应前常先用不合探针的预杂交液处理切片(与杂交温度相同，作用20min左右)。杂交谈的具体配制见本书杂交组织化学实验。第49页，共108页，2023年，2月20日，星期三硫酸葡聚糖（Dextransulphate）和甲酰胺（formamide）硫酸葡聚糖是核酸杂交液中仅次于甲酰胺的一种组成成份。在杂交液中，甲酰胺占50%左右，而硫酸葡聚糖占10%左右。它是一种大分子的多聚胺化合物，具有极强的水合（hydrate）作用，因而能大大增加杂交液的粘稠度。硫酸葡聚糖的主要作用：促进杂交率，特别是对双链核酸探针。第50页，共108页，2023年，2月20日，星期三

甲酰胺的主要作用：①在调节杂交反应温度方面，甲酰胺起了极为重要的作用，从而有助于保持组织的形态结构。②甲酰胺还可防止在低温时非同源性片段的结合，但甲酰胺具有破坏氢键的作用从而具有一种不稳定的作用。第51页，共108页，2023年，2月20日，星期三4

杂交后处理杂交后处理的目的是尽可能多地洗去未杂交或非特异吸附于切片上的探针，并通过免疫组化反应以显示靶核酸的存在与分布。洗片是减少背景着色的重要环节。通常用来洗片的液体是不同浓度的SSC。为提高洗片的效果，可以提高洗片时所用的温度、减低所用洗液的离子浓度和提高甲酰胺的浓度。在用RNA探针时还可用不合DNA酶的RNA酶处理切片，将残存的单链RNA探针消化掉，从而明显降低非特异性背景。第52页，共108页，2023年，2月20日，星期三

非放射性核素法标记探针在杂交后需经过显色反应来显示靶核酸的存在与分布，其方法与免疫组化法相同。为了减少显色过程中可能产生的非特异着色，在抗体反应液和洗液中可以加入Tween—20，并在滴加抗体前，切片失用动物正常血清或用试剂盒所带的特殊阻断剂孵育第53页，共108页，2023年，2月20日，星期三杂交严格度（Hybridizationstringency）

杂交条件的严格度（stringency）表示通过杂交及冲洗条件的选择对完全配对及不完全配对杂交体的鉴别程度。

第54页，共108页，2023年，2月20日，星期三低严格度（lowstringency）杂交及冲洗条件在Tm-35℃至Tm–40℃之间，高盐或低甲酰胺浓度。在这种条件下，大约有70%～90%的同源性核苷酸序列被结合，其结果是导致非特异性杂交信号的产生。中严格度，Tm-20℃至Tm-30℃的范围。高严格度（highstringency）为Tm-10℃至Tm-15℃，低盐和高甲酰胺浓度。第55页，共108页，2023年，2月20日，星期三

由于原位杂交技术多数是在Tm-25℃进行的，不属于高严格范围，无疑会产生非特异性结合导致信/噪比减低。在这种情况下，可用加强杂交后处理洗涤的严格度使非特异性的杂交体减少。由于RNA杂交的稳定性，应用cRNA探针进行细胞或组织的原位杂交时的杂交温度比其它核酸探针要高10～15℃。实验证明，cRNA产生的信号比双链cDNA要强。单链的RNA探针其杂交信号大于双链的cDNA的约8倍。第56页，共108页，2023年，2月20日，星期三5对照同免疫组化一样，每次进行原位杂交实验时也应设立若干个对照．以估计所用试剂的可靠性和结果的准确性，排除假阴性和假阳性的干扰。常用的对照有：第57页，共108页，2023年，2月20日，星期三1．标本对照阴性标本对照，即在个含相应靶核酸的组织或细胞片上进行原位杂交实验，以鉴定有无探针与组织或细脑的非待异结合。还可以用Dnase或Rnase处理阳性标本片，消化靶核酸后作为阴性对照.

阳性标本片对照．即每次实验同时加上一张阳性标本片进行原位杂交，其结果可以显示技术上的重复性(操作的正确与否、所用试剂的可靠性)。必要时还可用该基因产物的抗体染同一切片，对照杂交阳性产物的分布特点，在一定程度广也可提示杂交结果的正确性。第58页，共108页，2023年，2月20日，星期三2．探针对照探制的Northern印迹检测，可通过探针对组织总RNA的Northern印迹杂交带的分析，以明确探调的特异性。3．探针正义链阴性对照应用RNA探针时可以转录并标记与靶核酸序列相同的核酸片段(即正义链)，代替探针(反义链)进行实验，而其不能与靶核酸完成杂交，此即为正义链阴性对照。第59页，共108页，2023年，2月20日，星期三

4．未标记探针竞争抑制与免疫组化相同，在原位杂交实验中也可加入不同浓度的未标记探针，进行特异性竞争抑制。

5．不合探针的阴性对照即在杂交时用不含探针的杂交液作用，其意义主要在于对显色系统作阴性对照第60页，共108页，2023年，2月20日，星期三6．质粒对照即用不合探针片段的载体质粒DNA与标本片朵交，以排除因载体引起的非特异件着色.7．无关的标记探针对照使用已知标本片中不合有的核酸片段之标记探针进行杂交，其可以排除标本对探针的非特异性吸附的可能性。第61页，共108页，2023年，2月20日，星期三第62页，共108页，2023年，2月20日，星期三第63页，共108页，2023年，2月20日，星期三第64页，共108页，2023年，2月20日，星期三第65页，共108页，2023年，2月20日，星期三第66页，共108页，2023年，2月20日，星期三第67页，共108页，2023年，2月20日，星期三第68页，共108页，2023年，2月20日，星期三第69页，共108页，2023年，2月20日，星期三第70页，共108页，2023年，2月20日，星期三第71页，共108页，2023年，2月20日，星期三第72页，共108页，2023年，2月20日，星期三第73页，共108页，2023年，2月20日，星期三第74页，共108页，2023年，2月20日，星期三原位PCR方法第75页，共108页，2023年，2月20日，星期三逆转录PCR多重PCR反向PCR不对称PCR

锚定PCR

第76页，共108页，2023年，2月20日，星期三原位杂交技术的优缺点

原位杂交技术在显示阳性杂交信号(即特定的DNA或RNA)时,不仅能判断含有靶序列的细胞类型,还能显示组织细胞的形态结构特征与病理变化.

但是原位杂交对拷贝数较少的序列检出有一定的困难,而单拷贝序列或低拷贝序列(10-20拷贝的RNA或单拷贝DNA),则不能被检出,所以原位杂交的敏感性不够第77页，共108页，2023年，2月20日，星期三

PCR技术是在DNA聚合酶的作用下，经过模板的变性、退火和引物延伸三种循环，将引物引导下的特异性靶序列迅速地进行扩增，经过扩增的靶序列（一般能扩增106倍），很容易在凝胶电泳或Southern印记杂交中显示出来，因此，PCR技术具有灵敏度高，特异性强的优势，随着热循环自动化的提高与稳定也使得PCR技术的操作简便易行。PCR技术的优点第78页，共108页，2023年，2月20日，星期三PCR技术的缺点

但是，PCR技术是在液相中进行的，在扩增前，需将细胞破坏，从中提取核酸作为模板，因此很难将PCR的结果与组织细胞的形态结构联系起来，同时，也很难判断含特异性靶序列的细胞类型。

第79页，共108页，2023年，2月20日，星期三

原位PCR技术的基本原理，就是将PCR技术的高效扩增与原位杂交的细胞定位结合起来，从而在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定的DNA或RNA序列。

第80页，共108页，2023年，2月20日，星期三

原位PCR技术成功地将PCR技术和原位杂交技术结合起来，保持了两项技术的优势又弥补了各自的不足。第81页，共108页，2023年，2月20日，星期三原位PCR技术的待检标本一般先经化学固定，以保持组织细胞的良好形态结构。细胞膜和核膜均具有一定的通透性，当进行PCR扩增时，各种成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可进入细胞内或细胞核内，以固定在细胞内或细胞核内的RNA或DNA为模板，于原位进行扩增。扩增的产物一般分子较大，或互相交织，不易穿过细胞膜或在膜内外弥散，从而被保留在原位。这样原有的细胞内单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指数极扩增，扩增的产物就很容易被原位杂交技术检查。第82页，共108页，2023年，2月20日，星期三PCR技术的应用1组织细胞样品中病毒核酸探测2细胞内源核酸的探测3染色体基因定位4组织细胞基因表达的研究第83页，共108页，2023年，2月20日，星期三

直接法原位PCR技术直接法原位PCR技术是将扩增的产物直接携带标记分子，即使用标记的三磷酸腺苷或引物片断。当标本进行PCR扩增时，标记的分子就掺入到扩增的产物中，显示标记物，就能将特定的DNA或RNA在标本（原位）中显现出来。第84页，共108页，2023年，2月20日，星期三

间接法原位PCR技术

间接法原位PCR技术是先在细胞内进行特定DNA或RNA扩增，再用标记的探针进行原位杂交，明显提高了特异性，是目前应用最为广泛的原位PCR技术第85页，共108页，2023年，2月20日，星期三

间接法原位PCR与直接法不同的是，反应体系与常规PCR相同，所用的引物或三磷酸腺苷均不带任何标记物。即实现先扩增的目的，然后用原位杂交技术去检测细胞内已扩增的特定的DNA产物，因此，实际上是将PCR技术和原位杂交技术结合起来的一种新技术，故又称之为PCR原位杂交(PCRinsituhybridization,PISH)。间接法PCR技术的优点是特异性较高，扩增效率也较高。缺点是操作步骤较直接法繁琐。

第86页，共108页，2023年，2月20日，星期三

原位反转录PCR(insitureversetranscriptionPCR,InSituRT-PCR)是将液相的RT-PCR技术应用到组织细胞标本中的一种新技术，与RT-PCR（液相）不同点在于，进行原位反转录PCR反应之前，组织标本要先用DNA酶处理，以破坏组织中的DNA酶，这样才能保证扩增的模板是从mRNA反转录合成的cDNA，而不是细胞中原有的DNA。其它基本步骤与液相的RT-PCR相似。第87页，共108页，2023年，2月20日，星期三几本步骤原位PCR的基本步骤包括标本制备、预处理、原位扩增（PCR）、后处理和原位检测等，现分述如下；第88页，共108页，2023年，2月20日，星期三标本制备

1标本种类原位PCR可以在细胞悬液、细胞涂片、细胞离心标本、细胞分裂中期染色体标本、冰冻切片以及石蜡切片上进行，相比之下，以悬浮的完整细胞做原位PCR效果最好，细胞涂片和细胞离心标本次之，而切片标本最差。

第89页，共108页，2023年，2月20日，星期三2固定由于原位PCR要对扩增的靶序列进行细胞定位，因此标本需要固定。固定的目的不仅保存组织细胞的形态结构，便于定位，而且还要能保存用做PCR模板的起始物DNA或RNA。常用的固定剂，缓冲福尔马林（10％，4℃固定4-6h）和4％多聚甲醛，一般都能满足这一要求。

第90页，共108页，2023年，2月20日，星期三3预处理制备好的组织标本在进行原位扩增即PCR之前，一般都要用蛋白酶进行预处理。常用的蛋白酶有蛋白酶K、胰蛋白酶或胃蛋白酶。组织标本经蛋白酶消化后能增加通透性，允许反应试剂进入细胞内，并暴露靶序列，用以扩增。蛋白酶消化不足，则组织细胞的通透性差，而且蛋白质与核酸之间交联广泛。这些都会影响PCR反应，以导致假阴性结果。反之，消化过度则会破坏组织细胞的形态结构，也会使PCR产物易于通过破裂的膜结构向外弥散。第91页，共108页，2023年，2月20日，星期三4原位扩增原位扩增也即在组织细胞标本上进行PCR反应，其基本原理及反应条件与液相PCR相同，但由于PCR是在固定的细胞组织标本上进行，所以也有其特殊性。1引物原位PCR宜用较短的引物2反应体系原位PCR的反应体系与常规的液相PCR基本相同

第92页，共108页，2023年，2月20日，星期三5热循环

载玻片原位PCR的热循环可在专用的热循环仪上进行。最近生产的专用原位PCR热循环仪一次可同时放置12—20张玻片，操作简便。热量则通过载玻片传递给组织及整个反应系统。如果无专用的原位PCR仪，则可用常规PCRs循环仪代替。通常在样品台上覆盖一层铝箔，制成平台，载玻片即可置于平台上。第93页，共108页，2023年，2月20日，星期三6后处理原位扩增结束后，标本要轻轻地洗涤．以除去弥散到细胞外的扩增产物。洗涤不充分，会使弥散的扩增产物在检测时显现，造成背景过高或出现假阳性结果。反之，洗涤过度，可能将保留在细胞内的扩增产物洗脱，而造成阳性信号减弱。因此洗涤的程度要折衷于减低背景和保留强阳性信号这两个因素。虽然有的操作流程中没有扩增后洗涤，但一般还是将此步骤包括在原位PCR的操作规程中。

第94页，共108页，2023年，2月20日，星期三7原位检测PCR扩增产物的原位检测方法，取决于原位PCR的设计方案。

第95页，共108页，2023年，2月20日，星期三怎样设定原位PCR对照实验？

设立阳性对照，即用已知阳性细胞或组织切片做阳性标志，实验结果应呈阳性，表明实验方法准确可靠。同时要设立阴性对照，即用已知阴性细胞或组织切片作阴性对照，实验结果应呈阴性，表示实验方法无假阳性结果；也可以用实验细胞或组织切片，不加标记的dUTP（直接法），PCR结果显示阴性，或不加引物或不加TaqDNA聚合酶等，结果均应阴性。第96页，共108页，2023年，2月20日，星期三存在的问题与对策1引物错配2DNA修复和内源DNA延伸3pcr产物的扩散4扩增失败第97页，共108页，2023年，2月20日，星期三第七章光镜标本显微摄影技术第98页，共108页，2023年，2月20日，星期三显微摄影的特点1.摄影对象不同