鸭乙型肝炎病毒全基因重组质粒构建及表达解析

/鸭乙型肝炎病毒全基因重组质粒成立及表达作者：胡权,张正茂,张小勇,张振华,雷延昌,周敦金,黄建国,杨东亮【大纲】目的成立鸭乙型肝炎病毒（DHBV）感染性克隆，经过体外细胞转染获得单一本源、基因序列清楚的体内实验的感染毒种。方法以湖北麻鸭DHBV分别株（DQ276978）为模板，用PCR法从该DHBV全基因组克隆质粒（pMD-DHBV）和DHBV阳性血清中获得3部分基因片段，总长4?4kb，克隆至载体PCR2?1的SacI和NotI酶切位点，成立含1?5倍鸭乙型肝炎病毒全基因的重组质粒，并酶切判断其插入方向。将成立的重组质粒经脂质体LipofectineTM2000导入鸡肝癌细胞系(LMH)细胞中转染表达，收集纯化后的转染细胞培养上清液作为体内实验感染的标准毒种。结果PCR判断、酶切判断及序列测定，证明成功获得正向插入的1.5倍鸭乙型肝炎病毒全基因重组质粒。Southernblot检测表示，该重组质粒在LMH细胞内存在各种病毒复制中间体；经过电镜观察，转染细胞上清液中存在DHBV完满病毒颗粒。结论经体外重组，成立出携带1.5倍加长DHBV基因组片段的重组质粒PCR2?1-DHBV1?5，并可在鸡肝癌细胞LMH中介导高水平病毒复制，进而获得含可自我复制病毒颗粒的转染细胞上清液作为动物体内感染接种物。【要点词】鸭乙型肝炎病毒鸭乙型肝炎病毒（DHBV）与人类乙型肝炎病毒（HBV）同属嗜肝DNA病毒科，它们在形态结构、基因序列、病毒复制、致病体系及感染宿主规律等方面均较为相似，DHBV感染鸭模型令人们认识了嗜肝病毒的复制周期以及病毒连续存在和病毒完整除去的体系。我们在对湖北麻鸭DHBV自然感染率检查的基础上，选择对DHBV易感且取材方便的湖北麻鸭作为实验鸭种，并分别出1株DHBV新毒株（DQ276978）〔1〕。进而以该毒株为模板，成立了1?5倍DHBV全基因重组质粒，经过该质粒在鸡肝癌细胞系(LMH)中牢固转染表达出含有可自我复制的病毒颗粒的细胞培养上清液作为单一本源、基因序列清楚的实验毒种，以期成立标准化的湖北麻鸭乙型肝炎病毒体内模型。别的，将该DHBV重组质粒与不相同剂量人类载脂蛋白BmRNA编写酶催化多肽3G(APOBEC3G)真核表达质粒共转染LMH细胞，经过控制实验以证明该DHBV体外实验模型的初步应用。1资料与方法1?1资料1?1?1质粒pMD-DHBV为本实验室成立的含有湖北麻鸭（DQ276978）DHBVDNA全长基因组的质粒；pSP65-DHBV16为双拷贝头尾相接的全基因DHBVDNA重组质粒，该克隆质粒(美国Mandart教授馈送)；APOBEC3G真核表达质粒为本实验室成立保存；PCR2?1载体(美国Invitrogen公司)。1?1?2DHBV阳性血清取自扩增出DHBVDNA全长基因组（DQ276978）的阳性血清。1?1?3细胞禽类鸡肝癌细胞系LMH，为本室传代保存。1?1?4工具酶LATaq酶、限制性内切酶EcoRI、BamHI、SacI、KpnI、NotI及凝胶回收试剂盒(大连TAKARA公司)；TaqDNA聚合酶(美国Promega公司)；T4DNA连接酶(美国GIBICO公司)。1?1?5生化及其他试剂地高辛(DIG)标记及检测试剂盒(德国Roche公司)；Waymouth细胞培养基(美国Sigma公司)；LipofectineTM2000(美国Invitrogen公司)。DNA凝胶回收试剂盒、PCR产物回收试剂盒(德国QIAGEN公司)；质粒提取试剂盒和动物培养细胞基因组DNA纯化试剂盒(大连TaKR公司)。1?2方法经过对湖北麻鸭（DQ276978）DHBVDNA的全长克隆质粒的序列限制酶切图谱解析〔1〕，已明确其基因组的结构及与复制相关的重要元件的序列地址，在此基础上运用3片法成立出能自我复制的重组质粒。1?2?1成立质粒PCR2?1-DHBV1?5用EcoRI和BamHI双酶切pMD-DHBV，获得目的片段DA（DHBV3024/0nt-1473nt）；设计引物DB1/DB2和DC1/DC2分别经PCR扩增DHBV阳性血清获得目的片段DB（1473nt-2870nt）和DC（1395-3024/0nt）。将上述3片段插入PCR2?1的相应酶切位点后即获得1?5倍DHBV全基因重组质粒PCR2?1-DHBV1?5。1?2?2PCR判断引物Ps1/Ps2和Pc1/Pc2为DHBV基因S区和C区的高度保守序列段，引物序列以下：Ps11318F）5′-TGGCCTAATCGGATTACTGG3′，-Ps2（1739R）5′-CAGCGTGGCTAATTGAGTTA3′；-Pc1（187F）5′-GCAATCACTAGACCAATCCA3′，-Pc2（397R）5′-GAGATCTATGGTGGCTGCTC3′。-PCR反应液组成：10×Buffer5μl;MgCl2（25mmol/L）3μl;dNTP（10mmol/L）1μl;Ps1/Ps2或Pc1/Pc2各1μl；Taq酶1μl；DHBV模板5μl；加灭菌纯水至50μl。PCR循环参数：94℃5min；94℃50s,61℃45s,72℃50s,40个循环；72℃10min。1?2?3酶切判断用BamHI，SacI和EcoRI，NotI和EcoRI，SacI和BamHI分别进行酶切判断。1?2?4序列测定取一株阳性克隆质粒送上海生物工程技术服务公司测序。1?2?5脂质体LipofectineTM2000介导的DNA转染在LMH细胞达到80%～90%交融时进行转染，设未转染LMH细胞比较和pSP65-DHBV16质粒比较。1?2?6蛋白印迹(SouthernBlot)解析提取转染LMH细胞内总DNA后，用DIG标记的DHBV全长基因组探针杂交，X-ray胶片发光显影。1?2?7转染细胞上清液中病毒颗粒电镜观察收集转染细胞的上清液，离心后用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解积淀，将该积淀溶解物经过磷钨酸负染法进行电镜观察。1?2?8APOBEC3G真核表达质粒对DHBV的控制效应实验质粒PCR2?1-DHBV1?5分别与不相同剂量（20和40μg）的APOBEC3G真核表达质粒pXF3G-HA经过LipofectamineTM2000共同转染LMH细胞，72h后收集细胞。2结果2?1重组质粒PCR2?1-DHBV1?5的PCR判断重组质粒PCR2?1-DHBV1?5经不相同引物C1/C2、S1/S2、DB1/DB2和DC1/DC2扩增后可产生依次为211，452，1430和1600的目的片段（图1）。2?2重组质粒PCR2?1-DHBV1?5的酶切判断未酶切的重组质粒PCR2?1-DHBV1?5为8?4kb；用SacI和EcoRI双酶切该重组质粒可产生2?9和5?5kb的片段；该重组质粒经BamHI限制性内切酶消化后产生3?1和5?3kb的目的片段；用NotI和EcoRI双酶切PCR2?1-DHBV1?5可产生1?6和6?8kb的片段；用SacI和BamHI限制性内切酶消化该重组质粒后则产生1?6和6?8kb的目的片段。上述酶切结果均与预期相符（图2）。2?3转染细胞上清液中DHBV病毒颗粒的检测在转染细胞上清液中检出大量直径为30～65nm的球形颗粒，其中一种为大小较均一，直径为40～50nm的实芥蒂毒，有核心和球形包膜，即完满病毒颗粒；另一种是直径为30～65nm的类球形空芥蒂毒，中央凹陷，未见丝状、管状体，即病毒表面抗原颗粒（图3）。2?4转染细胞内DHBVDNA的检测分别将pSP65-DHBV16和PCR2?1-DHBV1?5转染LMH细胞，72h后收集细胞，提取DNA进行Southernblot检测。结果显示，重组质粒PCR2?1-DHBV1?5与双拷贝DHBV全长基因组质粒pSP65-DHBV16相同，均在转染细胞中检出大量DHBVDNA复制中间体（图4）。M：DL2000Marker;1：primerC1/C2;2：primerS1/S2;3：primerDB1/DB2；4：primerDC1/DC2图1重组质粒PCR2?1-DHBV1?5的PCR判断（略）M1：1KbMarker;1：；2：PCR2.1-DHBV1.5/SarIEcoRI;3

：PCR2.1-DHBV1.5/BamHI;4：PCR2.1-DHBV1.5/NotIEcoRI;5

：PCR2.1-DHBV1.5V/SacIBamHI;M2：500bpLadder图

2

重组质粒

的酶切判断（略）

2?5APOBEC3G对DHBV核衣壳相关DNA水平拥有剂量依赖的控制效应重组质粒PCR2?1-DHBV1?5分别与不相同剂量（20和40μg）的APOBEC3G真核表达质粒pXF3G-HA共同转染LMH细胞，转染后Southernblot检测细胞内的DHBV核衣壳相关DNA的结果显示，APOBEC3G对转染细胞内DHBV核衣壳相关DNA水平具有剂量依赖的控制效应（图5）。图3重组质粒PCR2?1-DHBV1?5转染细胞上清液(×60000)（略）1：pSP65-DHBV16;2:PCR2.1-DHBV1.5;RC：废弛环状DNA；L：线性DNA；SS：单链DNA图4Southernblot检测转细胞内DBBV复制水平（略）

PCR2?1-DHBV1.5(μg)202020

pXF3G-HA(μg)-2040

pXF3H(μg)4020-pXF3H：真核表达载体；pXF3H-HA：APOBEC3G真核表达质粒图5APOBE3G对细胞内DHBV核衣壳相关DNA水平的控制（略）3谈论在HBV己证明，成立1?3倍加长或头尾相接双拷贝的基因组，可以产生全部HBV转录子，并启动HBV的复制〔2〕。土拔鼠肝炎病毒(WHV)研究也有近似的结果〔3〕。LMH是DHBV牢固表达细胞系〔4，5〕，它能支持DHBV克隆病毒的复制，并能分泌完满病毒颗粒。本实验经过对湖北麻鸭DHBV分别株(DQ276978)的DNA全长基因组核苷酸水平和氨基酸水平的序列解析研究〔1〕，成功成立了1?5倍加长DHBV基因组重组质粒，经PCR判断、酶切判断以及序列测定均证明所成立的重组体与预期切合，包含能高效自我启动DHBV复制的全部元件。核酸水平研究和电镜观察也证明该重组质粒可以在LMH细胞中利用DHBV固有的增强子和启动子进行有效复制、转录及表达，由此也证明所成立的重组体可以用于体内基因免疫，为以后成立鸭体内实验感染标准化模型供应实验依据。别的，我们进一步用本实验室成立的APOBEC3G真核表达质粒和PCR2?1-DHBV1?5重组质粒共同转染LMH细胞系进行控制实验以证明该DHBV体外实验模型的初步应用。APOBEC3G是一种天然免疫分子，拥有抗病毒感染的效应6,7〕。实验结果显示，APOBEC3G能明显降低DHBV核衣壳相关DNA的水平，并且显示出剂量依赖性，表示APOBEC3G也可能非特异性地控制DHBV复制，但其作用体系尚待进一步研究。【参照文件】〔1〕胡权,雷延昌,张振华,等?湖北麻鸭乙型肝炎病毒全基因组的克隆和序列解析［J］.中国病毒学,2006,21(2):163-168.〔2〕TangH,McLachlanA.TranscriptionalregulationofhepatitisBvirusbynuclearhormonereceptorsisacriticaldeterminantofviraltropism［J］.ProcNatlAcadSciUSA,2001,98(4):1841-1846.〔3〕ZhangZ,ToriiN,HuZ,etal.X-deficientwoodchuckhepatitisvirusmutantsbehavelikeattenuatedvirusesandinduceprotectiveimmunityinvivo［J］.JClinInvest,2001,108(10):1523-1531.〔4〕CondreayLD,AldrichCE,CoatesL,etal.EfficientduckhepatitisBvirusproductionbyanavianlivertumorcellline［J］.JVirol,1990,64:3249-32585.〔5〕GongSS,JensenAD,RoglerCE.LossandacquisitionofduckhepatitisBvirusintegrationsinlineagesofLMH-D2chickenhepatomacells［J］.JVirol,1996,70:2000-2007.〔6〕ChangSF,NetterHJ,HildtE,etal.DuckhepatitisBvirusexpressesaregulatoryHBx-likeproteinfromahiddenopenreadingframe［J］.JVirol,2001,75:161-1707.7〕LenhoffRJ,LuscombeCA,SummersJ.Competitioninvivobetweenacytopathicvariantandawild-typeduckhepatit